新污染物共暴露会对污水处理厂活性污泥微生物群落结构产生重要影响，但卤代咔唑和纳米材料复合污染对活性污泥系统生态效应的研究尚未开展。本文选择低（0.05 mg/L）和高（5 mg/L）两种浓度的三氯咔唑（3-chlorocarbazole，3-CCZ）与1 mg/L纳米四氧化三铁（Fe₃O₄  nanoparticles，Fe₃O₄ NPs）作为胁迫条件，探究复合污染对活性污泥体系细菌群落的短期影响以及胁迫后体系对低温的响应，并利用网络关系图探究6个生物类群间的相互作用。研究可为污水处理系统卤代咔唑与纳米材料复合污染的风险评价提供新的思路与理论依据。

引用本文：樊晓燕, 张晓晗, 刘元坤, 耿文念, 王亚宝. 三氯咔唑与纳米材料复合污染胁迫对活性污泥微生物的影响[J]. 科技导报, 2025, 43(3): 105-114 #

目录

1、材料与方法

1.1 活性污泥微宇宙的构建与试验设计

1.2 DNA提取和测序分析

1.3 全尺度分类与功能属

1.4 网络分析

2、结果分析

2.1 微生物群落多样性与结构

2.2 丰富属和稀有属的响应

2.3 丰富属和稀有属间交互作用

2.4 功能微生物和功能基因

3、结论

氮污染是环境领域的一个严重问题，污水处理厂（wastewater treatment plants，WWTPs）广泛采用活性污泥法进行脱氮。活性污泥系统由复杂微生物群体构成，其中细菌群落在保持污水处理的稳定性方面发挥着重要作用，脱氮功能微生物如氨氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）、亚硝酸盐氧化细菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）和反硝化细菌（denitrifying bacteria，DNB）等在脱氮过程中发挥重要作用，另外，脱氮相关功能基因与脱氮性能之间也存在显著相关性。微生物群落依赖于不同分类群之间的相互作用，其中枢纽属或关键属对群落的稳定性很重要，有研究人员提出微生物全尺度分类法，可将微生物分为6类，目前研究多聚焦于相对丰度较高的菌属，而忽略了依然有重要作用的稀有类群。实际污水成分复杂，工业生产中出现的多种新污染物会在WWTPs中富集并对活性污泥体系产生影响，同时这些新污染物会形成复合污染，发生不同的相互作用对活性污泥产生更为复杂的影响。因此，探究新污染物复合污染胁迫对活性污泥系统中微生物群落的影响具有重要意义。

卤代咔唑（polyhalogenated carbazoles，PHCs）是一类具有潜在持久性、生物累积性和毒性的物质，目前已在国内外多数水域中检测到。三氯咔唑（3-chlorocarbazole，3-CCZ）是其中最常见的PHCs种类，具有类二噁英毒性。纳米材料（nanoparticles，NPs）特别是铁基NPs由于其独特的性能被大量利用，Fe₃O₄ nanoparticles（Fe₃O₄ NPs）是其中受到关注较多的材料并且被发现对废水处理过程有重大的影响。

基于上述论点，本文研究了不同浓度3-CCZ与Fe₃O₄ NPs形成的复合污染对活性污泥体系中细菌群落的影响，并且探究了低温环境下复合污染胁迫对体系的影响。为探索3-CCZ与Fe₃O₄ NPs复合污染提供了新视角，以期为推动PHCs与NPs复合污染的环境风险评价提供理论基础。

1、材料与方法

1.1 活性污泥微宇宙的构建与试验设计

本研究分为2个阶段，3-CCZ的环境浓度为ng/L级别，考虑到其累积性，选择了2种浓度：低浓度（L：0.05 mg/L）和高浓度（H：5 mg/L）。第一阶段是考察3-CCZ和 Fe₃O₄ NPs 复合污染对活性污泥短期胁迫的影响；第二阶段为考察低温环境下3-CCZ与Fe₃O₄ NPs复合污染胁迫对活性污泥系统微生物的影响。

1.2 DNA提取和测序分析

在第14周期和第27周期结束时从反应器中收集污泥样品，共得到8个样品使用lllumina MiSeq PE300测序仪（lllumina，USA）进行细菌16SrRNA 基因（V3~V4区）测序（美吉生物云平台）。将有效序列按照相似度>97%划分到相同的操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）。 通过RDP数据库对OTUs进行物种注释。利用Shannon指数和Chao1指数评估微生物多样性和丰富度，同时，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）探究微生物群落结构。

1.3 全尺度分类与功能属

采取全尺度分类方法将细菌划分为6个类群。根据先前的研究，选择了脱氮功能属，包括氨氧化细菌（AOB）、亚硝酸盐氧化细菌（NOB）和反硝化细菌（DNB）进行详细分析。

1.4 网络分析

建立相关性网络以研究微生物菌属在不同条件下的相互作用。使用R（V4.3.1）计算了微生物菌属之间的Spearman等级相关系数（SRCCs），构建相关矩阵，P≤0.05定义为显著相关，使用Gephi（V0.92）展示微生物菌属（6大类）之间的网络关系。

2、结果与分析

2.1 微生物群落多样性与结构

各样品的多样性指数和丰富度指数变化如图1（a）所示，无论是胁迫阶段还是低温阶段，各样品间Shannon指数的变化范围在10%以内，说明各样品中微生物群落多样性变化较小，污染物的添加对活性污泥体系微生物群落多样性的影响不显著。总之，污染物的添加对活性污泥体系中微生物群落丰富度会有不同程度的影响，但不会影响微生物多样性，并且3-CCZ与Fe₃O₄ NPs的复合污染在常温与低温下对体系微生物丰富度产生了不同的作用。

通过PCA对复合污染下微生物的群落结构进行分析，如图1（b）所示，整个微生物群落可分为2个组别，同一个阶段的样品聚在一起，说明了低温对微生物群落结构的改变。

图1 微生物群落Shannon指数和Chao1指数（a）以及微生物群落结构PCA分析（b）

2.2 丰富属和稀有属的响应

基于微生物全尺度分类，共得到6类细菌菌群（AT、CAT、CRT、CART、MT 和 RT）。AT与CAT是整个微生物群落中占主导地位的微生物类群，其次是CRAT和CRT，MT与RT占比极少。为进一步研究，把菌群分为丰富类和稀有类2大类。如图2（b）所示Saccharimonadales是AT中的唯一菌属，它是一种反硝化细菌，可在部分反硝化中发挥关键作用。在CAT中（图2（c））胁迫阶段各体系微生物相对丰度整体高于低温阶段，而在不同阶段内试验组与对照组微生物相对丰度的趋势则相反。在CRAT中（图2（d）），没有一种菌属一直占主导地位。MT（图2（e））中含5个属：Nitrospira、硝化螺旋菌属（Microbacterium）、腐败螺旋菌属（Saprospiraceae）、JG30-KF-CM45和C10-SB1A，占主导地位的是Nitrospira，它是硝化微生物中种类最多的一种，在自然和工程环境的硝化作用中具有重要意义。在本研究中，有98个属被分类为CRT，选择前20的属进行分析（图2（f））。没有一种菌属一直占有主导地位，且各菌属在不同样品中的分布规律并不明显，这说明一部分稀有菌属对污染物比较敏感，受到影响比较明显，对于RT（图2（g）），分析了503个属中的前20个，每个属在不同样本中的分布是不规则的，进一步说明了稀有属对污染物更为敏感，与CRT不同的是，低温下污染物的添加使得RT类相对丰度有所上升。总的来说，稀有属微生物对污染物的添加更为敏感，而丰富属微生物则对不同浓度的复合污染更为敏感，可能是污染物间存在的不同种相互作用，另外复合污染的胁迫也会改变某些菌属对低温环境的响应。

图2  6个微生物类群相对丰度变化：总类群（a）；AT（b）；CAT（c）；CRAT（d）；MT（e）；CRT（f）；RT（g）

2.3 丰富属和稀有属间交互作用

自然生态系统中的微生物并不是作为个体种群单独存在的。相反，它们相互作用，形成复杂的微生物群落。本研究通过网络分析探究微生物间交互作用（图3）。胁迫阶段和低温阶段的交互网络中分别有391和502条共现关系，微生物之间多为共现模式并且低温下微生物之间的交互作用更为复杂。此外，还对6个细菌分类群的核心属进行了探索。总之，CAT和CRT是核心分类单元，与其他分类单元有着复杂的相互作用，同时，稀有类群与其他类群也存在复杂的网络关系。

图3 复合污染下6个微生物类群间的相互作用：胁迫阶段（a）；低温阶段（b）

2.4 功能微生物和功能基因

对2个阶段中的脱氮功能属进行讨论。本研究中检测到的AOB是Nitrosomonas（图4（a）），Control中未检测出该菌属，其余体系中Nitrosomonas相对丰度有所增长尤其是CCZ_H，可能复合污染物可以促进其生长并且Nitrosomonas对高浓度3-CCZ与Fe₃O₄ NPs的复合污染更敏感。Nitrospira属于NOB，其与亚硝酸盐氧化成硝酸盐的过程密切相关，2个阶段中各样本NOB的相对丰度变化都较小（图4（b）），说明Nitrospira对3-CCZ与Fe₃O₄ NPs在短期内并不敏感。

DNB是占比最高的脱氮功能微生物（图4（c）），一共发现17个DNB。总体而言，相较于AOB与NOB，DNB受到3-CCZ与Fe₃O₄ NPs复合污染影响更明显，一些DNB如Hydrogenophaga和Thauera得到了富集。

检测到与硝化作用有关的基因amoA、amoB、amoC和 hao（图4（d）），说明不同浓度3-CCZ与Fe₃O₄ NPs的复合会对氨氧化基因产生不同影响，将反硝化作用的关键基因NO₃^-—N分为还原基因（narGHI和napAB NO₂^-—N）和还原基因（nirKS、norBC和nosZ）（图4（d））。总体来说，硝化作用相关功能基因对不同浓度3-CCZ复合污染的反应不同，复合污染胁迫对反硝化功能基因的影响在低温阶段更大，大部分反硝化基因的相对丰度有所上升。

图4 复合污染对功能菌属（a）~（c）和功能基（d）的影响

3、结论

1）3-CCZ与Fe₃O₄ NPs复合污染抑制了活性污泥微生物群落丰富度，但复合污染对群落多样性并没有明显影响。复合污染的添加和低温都会改变微生物群落结构，并且低温阶段中试验组微生物群落结构与对照组差别更大。

2）不同类群微生物对3-CCZ与Fe₃O₄ NPs复合污染的响应不同，稀有属对污染物的添加更敏感，丰富属中的Saccharimonadales和TM7a一直是优势菌属。CRT与CAT分别是胁迫阶段和低温阶段下微生物交互网络中的核心分类单元，同时稀有属与丰富属之间也存在着复杂的关联。

3）功能微生物中AOB与NOB受复合污染影响较小，DNB的相对丰度则有较大变化尤其在低温阶段，低温下低浓度3-CCZ与Fe₃O₄ NPs复合污染促进了氢噬菌（Hydrogenophaga）和陶厄氏菌（Thauera）的生长。高浓度 3-CCZ与Fe₃O₄ NPs的复合会引起氨氧化基因的富集，反硝化功能基因nosZ、nirKS和norBC对复合污染产生了不同的反应，nosZ的相对丰度在污染物添加之后下降，后者相对丰度则上升。

综上，常温与低温条件下3-CCZ与Fe₃O₄ NPs短期复合污染对活性污泥系统丰富-稀有菌属、脱氮功能菌及相关基因的影响存在差异。仍需进一步系统探究不同浓度水平下复合污染长期胁迫下活性污泥系统效能、群落演替、污染物降解机制及耐药菌鉴定等，以期为污水处理系统卤代咔唑与纳米材料复合污染的风险评价及控制提供更为完善的理论依据。

本文作者：樊晓燕、张晓晗、刘元坤、耿文念、王亚宝

作者简介：樊晓燕，北京工业大学城市建设学部，北京工业大学重庆研究院，副教授，研究方向为水污染控制。