植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility, CMS）是一个广泛存在并具有重要应用价值的生物学现象，也是研究细胞核与线粒体相互作用的经典系统。Ogura型CMS 系统在现代农业中发挥着非常重要的作用，它用以生产欧洲、北美和澳大利亚 1/3 的杂交油菜。尽管如此，其恢复基因Rfo 是如何抑制CMS的活性尚未得到明确证实。

近日，法国农业、食品与环境研究院（INRAE）Jean-Pierre Bourgin研究所王传德博士等在PNAS发表题为The radish Ogura fertility restorer impedes translation elongation along its cognate CMS-causing mRNA 的研究论文，率先明确解释了Ogura细胞质雄性不育的育性恢复分子机理。该研究发现，育性恢复PPR-B蛋白特异结合在不育基因orf138的编码区内，抑制了orf138 mRNA翻译延伸，降低Orf138蛋白含量，从而达到育性恢复的目的。

植物细胞质雄性不育是一种核质互作抑制有效花粉产生的遗传性状，属母性遗传。在雄性不育材料中，雄性器官发育异常，不能产生有功能的花粉，而雌性器官的发育和植株的营养生长正常，因此细胞质雄性不育被广泛应用于杂交制种。细胞质雄性不育通常与线粒体基因组中的异常开放读码框（ORF）相关。多数情况下，雄性不育可以由细胞核编码的育性恢复基因（Rf）所恢复。细胞质雄性不育（CMS）与育性恢复（Rf）调控网络受控于细胞质和细胞核两套遗传系统，是研究核质互作理想的模式系统 (Chen et al., 2014）。在过去的几年里，在各种作物中鉴定了数个Rf 基因，其中大部分编码由PPR基序串联组成的PPR (pentatrico-peptide repeat)蛋白。PPR 蛋白是高度特异性的 RNA 结合蛋白，在真核生物中广泛存在，主要存在于陆生植物中。PPR 蛋白已被证明在线粒体和叶绿体 RNA 表达过程中发挥着多种作用，从转录水平到 mRNA 翻译 (Barkan et al., 2014)。

Ogura不育源是日本科学家Ogura首次在萝卜中发现的天然雄性不育类型，雄性败育彻底，是迄今为止在十字花科植物中发现的不育性最为彻底的胞质不育源之一。由于其优良的不育特性，经过几代人的努力，Ogura CMS 已通过远缘杂交和原生质体融合成功转移到甘蓝型油菜中。目前Ogura CMS 是北美及欧洲等地主要应用于生产油菜杂交种的细胞质雄性不育类型。Ogura-CMS 属核质互作雄性不育类型，其育性由线粒体嵌合基因 orf138 和细胞核育性恢复基因 PPR-B (Rfo)控制。前期研究发现PPR-B蛋白不影响不育基因orf138转录模式，包括转录本丰度、大小及稳定性，故而推测PPR-B影响orf138 mRNA 的翻译或翻译后调控，但其中确切的分子机制尚未明确 (Uyttewaal et al., 2008)。

本文作者首先利用免疫印记，体外细胞器翻译及多聚核糖体沉降分析，表明PPR-B 对 orf138 mRNA 与多核糖体结合有负面影响并且PPR-B 介导的翻译抑制是 orf138 所特有的。为了更好地了解 PPR-B抑制orf138翻译抑制的起源，作者采用了翻译组和转录组（Ribo-Seq，RNA-seq）分析，用以比较不育系和恢复系中线粒体编码的 mRNA 的翻译状态。对Ribo-seq数据和RNA-seq数据的比较分析表明，在转录水平上，PPR-B 对线粒体的大部分mRNA 丰度没有重大影响；而翻译水平上，与 CMS 系相比，恢复系中orf138 mRNA翻译效率降低了16倍，而其它大多数线粒体mRNA翻译效率降低了不到2倍。以上结果再次表明，恢复系中缺乏 Orf138 蛋白是由于 orf138 mRNA 翻译被PPR-B严重抑制。

前期研究表明 PPR-B 在体内与 orf138 mRNA 特异性结合。为了了解这种关联是如何对 orf138 翻译产生负调控，作者试图鉴定 orf138 mRNA中 PPR-B 的结合位点。作者首先利用PPR蛋白识别代码（PPR code）来预测PPR-B蛋白的RNA结合区域，鉴定出一个位于orf138 起始密码子下游 55 个核苷酸的短片段的结合区域。进一步的RIP-seq分析，发现了一个包含67 个核苷酸区域在 PPR-B 免疫沉淀中高度且特异性地富集，并且该区域位于 orf138 编码序列内，包括所预测的 PPR-B 结合位点。随后的凝胶迁移实验表明，PPR-B蛋白与之前鉴定的RNA结合区域都显示出清晰而强烈的结合亲和力。总之，这些结果表明育性恢复PPR-B蛋白与orf138 mRNA 的编码序列特异性相结合。

鉴于PPR-B 结合位点在 orf138 编码序列中，促使研究者详细分析了在PPR-B存在或不存在的情况下沿 orf138 mRNA的核糖体足迹分布。研究人员比较了恢复系和CMS系中PPR-B蛋白在orf138 结合位点前后转录本上核糖体覆盖的平均数量，发现相比结合位点之前，位于 PPR-B 结合位点下游的 orf138 片段的核糖体密度的短缺更为显著，并且与观察到的恢复系中 orf138 基因的翻译减少具有相同的幅度。这表明恢复蛋白PPR-B不影响orf138的翻译起始，而是PPR-B结合在orf138的编码序列内，并充当核糖体阻滞剂，阻碍沿orf138 mRNA的翻译延伸。

综上所述，本研究专注于油菜Ogura 雄性不育及恢复系统，揭示了细胞核育性恢复基因PPR-B通过特异性抑制线粒体编码的不育基因orf138 mRNA翻译来恢复其雄性不育性状，同时还证明 PPR-B 结合orf138 的编码序列内，充当核糖体阻滞剂，特异阻止沿 orf138 mRNA 的翻译延伸。对 PPR-B 生化活性的分析揭示了一种新的翻译调控模式，该方式导致线粒体转录物的翻译延伸停止。最近对 PPR 识别代码的破译允许重新编码 PPR 蛋白以结合任何感兴趣的RNA序列，因此本研究也为今后合成那些本身缺乏有效天然恢复基因的CMS系统的育性恢复蛋白奠定了基础。

Fig.7. Ogura型育性恢复蛋白分子作用模型。

值得一提的是，该研究是法国农科院王传德博士继MTSF2蛋白参与线粒体nad1 前体mRNA 稳定性调节(Nucleic Acids Research, 2017), 核糖体蛋白uL18调控细胞器（线粒体和叶绿体）内含子剪切（PNAS, 2020）等研究之后，再一次深入解析了RNA结合蛋白对植物半自主细胞器基因表达的调控机制，并发现了一种调控线粒体翻译的新机制。

法国农业、食品与环境研究院（INRAE）Jean-Pierre Bourgin研究所王传德博士是本文的第一作者，Hakim Mireau研究员为通讯作者。该工作得到法国国家科研署基金，巴黎萨克雷大学植物科学中心等经费支持。

专家点评

汤继华 教授（河南农业大学，教育部长江学者）

植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility, CMS）是主要农作物杂种优势利用的重要手段，也是核质互作研究中的经典系统，受到科研工作者广泛的关注。前人通过对水稻、玉米、油菜等植物细胞质雄性不育恢复分子机制的大量研究，发现恢复基因主要通过改变不育基因结构、剪切或降解不育基因的转录本、抑制或降解不育基因蛋白等几种途径致使不育基因功能丧失或降低，从而使不育系的育性得到恢复。近日法国农业食品与环境研究院（INRAE）Jean-Pierre Bourgin研究所的王传德博士等在PNAS上发表了“The radish Ogura fertility restorer impedes translation elongation along its cognate CMS-causing mRNA”的研究报道，揭示了油菜Ogura细胞质雄性不育的育性恢复的一种新的分子机理。该研究发现，油菜Ogura细胞质不育的恢复基因Rfo编码一个PPR-B蛋白，该蛋白特异结合在不育基因orf138的编码区，抑制了orf138 mRNA翻译延伸，降低Orf138蛋白含量，从而达到育性恢复的目的。该工作不但首次详细揭示了油菜Ogura细胞质雄性不育育性恢复的抑制翻译减少有害蛋白的分子机制，更为设计人工恢复基因打开了一扇大门，即可以通过精心设计PPR基序，使其特异结合某不育系的不育基因上从而促使其育性恢复。相比其他设计方案如剪切、编辑等，该方法具有更好的可操作性，因此该研究结果为细胞质雄性不育在未来生产上大规模应用提供了一条新的策略。

参考文献：

Chen L, Liu YG. Male sterility and fertility restoration in crops. Annu Rev Plant Biol. 2014;65:579-606. doi: 10.1146/annurev-arplant-050213-040119.

Barkan A, Small I. Pentatricopeptide repeat proteins in plants. Annu Rev Plant Biol. 2014;65:415-42. doi: 10.1146/annurev-arplant-050213-040159.

Uyttewaal M, Arnal N et al., Characterization of Raphanus sativus pentatricopeptide repeat proteins encoded by the fertility restorer locus for Ogura cytoplasmic male sterility. Plant Cell. 2008 Dec;20(12):3331-45. doi: 10.1105/tpc.107.057208.

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