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Science Advances：用基因编辑技术在斑马鱼中快速生成母体突变体

发布时间： 2021-08-12

母体产物是驱动卵子发生和早期胚胎发育的唯一因素。由于破坏母体基因功能既耗时又具有技术挑战性，因此受母体因素调控的早期发育程序仍然难以捉摸。

2021年8月6日，山东大学邵明团队在Science Advances 在线发表题为“Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish”的研究论文，该研究提供了一种转基因方法来灭活斑马鱼原代卵母细胞中的母体基因。通过将三个串联单向导 RNA (sgRNA) 表达盒和绿色荧光蛋白 (GFP) 报告基因引入Tg(zpc:zcas9) 胚胎，有效地在 GFP 阳性 F1 后代中获得了母体 nanog 和 ctnnb2 突变体。

值得注意的是，这些母体突变体中的大多数都显示出跨越 sgRNA 位点的基因组缺失或从 sgRNA 靶标远处延伸的意外大缺失，表明卵母细胞中基因组编辑的显著缺失倾向。因此，该研究的方法允许在没有可行和可育的纯合突变的情况下敲除母体基因。这种方法特别节省时间，可用于母体因素的功能筛选和在斑马鱼中产生基因组缺失。

母体提供的 mRNA 和蛋白质由斑马鱼中超过一半的编码基因产生，控制卵子发生和胚胎发育的最早过程，尤其是在合子基因组激活之前的那些。一些母体因素也可以在早期发育过程中发挥合子功能。因此，消除母体和合子产物对于阐明具有母体表达的基因的功能作用至关重要。然而，大多数母体基因产物是细胞自主沉积在与体细胞具有相同基因型的原代卵母细胞中。因此，要通过传统的遗传方法产生母本 (M) 或母本合子 (MZ) 突变后代，有活力和可育的纯合突变雌性是必不可少的。这些纯合突变体通常以耗时的方式通过重复杂交和筛选典型地三代（在斑马鱼中近 9 个月）产生。

然而，如果合子基因功能的丧失导致死亡或不育，那么产生母体突变体就变得特别困难。规避这些障碍的一种方法是通过注射野生型 mRNA 来挽救表型缺陷，例如 Moep 突变体的产生，但这种方法被证明仅适用于一小部分合子致死基因。还开发了几种替代方法，例如生殖细胞置换、原位卵母细胞显微注射 、遗传嵌合雌性的生等。这些方法在技术上仍然具有挑战性、耗时或效率较低。因此，一种快速而直接的灭活卵母细胞基因的系统可能会打破研究其母体功能的障碍。

CRISPR-Cas9 系统已成为基因组编辑的强大工具，促进了广泛的功能分析 。基于 CRISPR-Cas9 的条件敲除已在多种物种中进行了测试，包括斑马鱼、小鼠和蚊子。实现组织特异性或时间控制基因失活的策略依赖于转基因和使用启动子来驱动 Cas9 蛋白的时空表达。然而，Cas9 介导的条件敲除的应用仍然有限，可能是由于效率低和嵌合现象或无法确保完整的双等位基因突变。这些通常会导致组织特异性基因产物的不完全去除或野生型或杂合细胞的功能补偿，从而产生没有可检测突变表型的动物。

与组成细胞作为一个整体发挥功能的组织或器官不同，卵巢中每个具有双等位母体基因破坏的卵母细胞都可以导致产生同质的母体突变动物。因此，推断 CRISPR-Cas9 介导的卵母细胞特异性条件敲除仍应高度适用于创建母体突变体，尽管 CRISPR-Cas9 系统在转基因中具有中等效率和镶嵌特征。

透明带基因 zp3b（也称为 zpc）在卵母细胞的早期阶段特异性表达，其启动子可以驱动绿色荧光蛋白 (GFP) 的高水平母体表达。已经创建了一个转基因品系 Tg(zpc:zcas9)，它在卵母细胞中特异性表达，并通过将单向导 RNA (sgRNA) 注射到胚胎中来测试其在常规基因失活中的应用。在这项研究中，开发了一种快速条件敲除策略，以仅一代（不到 3 个月）生成母体突变体。通过 I-SceI 介导的转基因将单个或多个 sgRNA 表达模块引入 Tg(zpc:zcas9) 胚胎，该已经成功地在 F1 胚胎中生成了 nanog 和 ctnnb2 (β-catenin2) 基因的母体突变体。该研究还发现斑马鱼卵母细胞中基因组编辑的显著趋势在表达多个 sgRNA 时经常产生可遗传的大缺失。因此，该研究证明了这种条件性敲除策略在规避当前母体因素功能研究中的技术限制方面的潜力。

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