​原标题：《Nat Commun丨卞小莹组开发新型革兰阴性细菌底盘促进天然产物挖掘》

微生物是药物和生物农药的重要来源。基因组中含有大量的隐秘或“沉默”天然产物生物合成基因簇，其编码产物代表着生物活性代谢物的大量未勘探的活性天然产物资源【1】。天然产物生物合成基因簇在高效底盘细胞中的异源表达有利于提高产量和挖掘新型天然产物【2】。

底盘构建是一直是合成生物学和天然产物绿色生物制造的核心。但由于缺乏高效的底盘菌，革兰阴性菌中的隐性生物合成基因簇的挖掘长期受限。前期研究中，β-变形菌纲的伯克氏菌DSM 7029（现鉴定为Schlegelella brevitalea）生长较快，遗传操作容易，次级代谢丰富，以成功表达多个黏细菌来源的非核糖体多肽/聚酮类复杂天然产物，如抗癌药物埃博霉素，具有成为通用天然产物底盘的潜力【3-5】。但是该菌在液体培养早期即会发生严重的细胞自溶，显著影响了生物量并限制了目标化合物的异源表达产量，阻碍了其进一步的应用。虽然在培养基中添加大量蔗糖能够在一定程度上延缓细胞死亡并延长发酵周期【6】，但是该菌细胞自溶机制还不清楚，能否利用基因组修饰延缓自溶还有待验证。

2021年7月23日，山东大学卞小莹课题组在Nature Communications在线发表了题为Rational construction of genome-reduced Burkholderiales chassis facilitates efficient heterologous production of natural products from proteobacteria 的研究论文，该研究利用前期构建的高效基因组编辑技术对伯克氏菌DSM 7029进行理性基因组简约化，其中删除转座子、原噬菌体的菌株表现出优化的生长表型，显著减轻了细胞早期自溶，并初步揭示了自溶机制。利用该优化底盘，显著提高了抗癌药物埃博霉素等六个异源天然产物的产量和鉴定了几丁质单胞菌中的一类新型的非核糖体肽化合物，优于常用的革兰阴性细菌底盘--大肠杆菌和恶臭假单胞菌。因此构建了具有自主知识产权的革兰阴性菌底盘，有望成为表达革兰阴性菌基因簇的优质底盘，用于天然产物挖掘和改造。

在这项研究中，作者通过生物信息学分析，合理设计了两条平行删除路线，并利用课题组前期建立的基因组编辑技术连续删除大片段基因组序列【5】，构建了多个基因组合理简约化的突变株（图1）。

图1. 基因组简化突变株构建流程图。左基因组图谱代表野生型伯克氏菌DSM 7029基因组，目标删除的生物合成基因簇区域用黑色的加粗短线表示，目标删除的转座酶、基因组岛、原噬菌体等区域用黑色的两个相对三角表示。

在第一条基因组简化路线中，连续删除多个内源次级代谢生物合成基因簇后得到了DC系列突变株，虽然代谢背景有显著降低，但其中DC5 ~ DC7突变株的细胞生长明显受到了影响，并在液体培养早期即表现出细胞脆弱性（图2）。与之相反在第二条简化路线中，连续删除多个转座酶、基因组岛、前噬菌体和相邻非必需基因后得到了DT系列突变株，且DT系列突变株表现出明显优化的生长特性以及显著减轻的细胞自溶（图3），并且具有更小的细胞形态和对外源DNA更高的电转化效率。因此在DT7基础上继续删除次级代谢基因簇构建了代谢背景降低的DT8~DT10。

图2. DC系列基因组简约化突变株的生理表型鉴定。a. 野生型伯克氏菌DSM 7029与突变株DC1~DC7的生长曲线；b.野生型伯克氏菌DSM 7029和突变株DC4~DC7在CYMG液体培养基中培养24小时，48小时和72小时时扫描电子显微镜下的细胞形态。

接着作者对DT系列突变株中优化的生长表型与减轻的细胞自溶现象进行研究。由于群体感应系统在伯克氏菌属中广泛存在，已有研究证明其在营养物质获取与细胞稳态维持等关键的细胞生命过程中发挥重要作用，随即作者对DT系列突变株中删除的基因组区域进行生物信息学分析，对16个假定的细胞群体感应相关及自溶相关调控因子进行单敲除，初步鉴定了DSM 7029中的细胞生长相关负调控因子，如Tet/AcrA家族转录调控因子和LysR家族转录调控因子。同时根据单敲除实验，作者提出 DT6~DT10突变株中出现的自溶现象的显著减轻可能与裂解酶编码基因或自溶相关负调控因子的删除有关，比如得到鉴定的裂解酶和XRE家族转录调节因子。

此外，作者通过位点特异性重组介导的外源基因簇整合方式，比较了抗癌药物埃博霉素等六个来源于伯克氏菌或黏细菌的天然产物异源表达的相对产量，并根据DT系列突变株中异源表达的产量均高于在DSM 7029野生型和其他两株广泛应用的革兰阴性底盘菌大肠杆菌和恶臭假单胞菌中异源表达的产量，论证了DT6~DT10基因组合理简约化突变株的优良底盘菌特性，其中DT8~DT10突变株具有更低的代谢背景及更高效的异源表达能力，可以作为优选底盘菌进行应用。

最后，一个来源于革兰阴性细菌几丁质单胞菌Chitinimonas koreensis DSM 17726中的隐秘生物合成基因簇chm在DT系列突变株中成功得到异源表达，且异源表达的产量较DSM 7029野生型和本源菌DSM 17726相比显著提高，得以鉴定了一系列新型天然产物chitinimides A-H。该研究拓展了detoxin/rimosamide生物合成基因簇家族至革兰阴性变形菌中，且这类天然产物表现出的抗抗生素活性表明这些微生物具有复杂的生态学意义，关于chitinimides的生物学功能和活性仍然需要进一步的研究。

本研究构建了一系列基因组合理简约化伯克氏菌DSM 7029底盘菌表现出了显著提高的生长特性以及优化的异源表达革兰阴性细菌天然产物的效率，扩展了革兰阴性菌底盘，而且具有成为通用天然产物底盘的潜力，进一步促进了基于基因簇异源表达的新型天然产物的定向挖掘和目标产物的产量提高。而且本研究再次证明组合删除转座子、插入序列和原噬菌体等非必需基因是构建最优底盘的一种可行方法【7】，为更多细菌底盘和细胞工厂的构建提供了范例。

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