作者：章台柳

制版人：十一

原发性小头畸形是一种神经发育疾病，特征是头围显著减小。遗传性原发性小头综合征通常只存在单基因突变，研究这些基因可揭示出神经发生和人脑大小控制的关键机制。目前为止，发现有27个基因与小头畸形有关，其中涉及中性粒/纺锤体生物发生和DNA损伤反应等途径【1】。而临床基因组测序研究将100多个基因与该病关联起来，但大部分没有被研究【2】。另外研究人脑发育和小头畸形的难点之一在于缺乏合适的模型系统。人体细胞的2D培养和小鼠模型均不能重现病人的表型，人脑的类器官3D培养或可用于研究小头畸形基因。然而，脑的类器官具有几个缺点：遗传敲除单个基因耗时较长，大规模批量研究候选基因目前缺乏可行性，系统的loss-of-function（LOF）方法不可用，因此需要建立新的研究方法。

近日，来自奥地利维也纳医科大学的Jürgen A. Knoblich在Science杂志发表文章 A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain size determinant，研发出一种在异质性组织中于细胞水平上利用CRISPR敲除并进行谱系追踪的技术（CRISPR-LIneage tracing at Cellular resolution in Heterogenous Tissue，CRISPR-LICHT），可实现在人脑的类器官组织中进行并行的LOF研究。对173个小头畸形的候选基因进行CRISPR-LICHT研究，发现25个参与小头畸形相关通路。其中IER3IP1蛋白调控内质网的未折叠蛋白反应（UPR）和细胞外基质蛋白（ECM）的分泌，对组织完整性至关重要，IER3IP1的功能失调导致小头畸形。

研究人员首先优化了背侧前脑组织（小头畸形主要影响的脑区）的类器官培养，基因表达和IHC都显示出背侧前脑的特征。培养17天时，神经发生几乎没有检测到；而28天和42天时，神经元广泛存在。其次，研究人员在H9 hESC细胞系中表达了脱靶减少的eCas9和dTomato报告基因，以便实现LOF的筛选。随后，使用病毒DNA标签文库转染hESC，便于在后续的实验中对细胞谱系进行追踪。2D培养的细胞生长较为平均，谱系分布较为均匀，而脑类器官组织生长呈现出不均匀的状态，与组织干细胞生长类似。这种不均匀的生长动力学可以区分由于内在的变异性而引起的细胞数量变化和gRNA介导的突变效应，这是传统的筛选方法所不能实现的。随后，研究人员先后在gRNA上引入谱系DNA标签和细胞测序过程中加入单细胞标签，可以克服小头畸形阴性选择过程中组织变异、谱系生长不均、读出灵敏度低等问题，可在类器官培养中实现快速平行地筛选LOF基因的目的。即异质组织中细胞分辨率水平的CRISPR谱系追踪（CRISPR-LICHT）。

CRISPR-LICHT技术流程图

利用CRISPR-LICHT技术在脑类器官中对172个小头畸形候选基因进行筛选，其中未靶向对照gRNA（阴性对照）和细胞增殖gRNA（阳性对照）的丰度显示出正常或被删除的状态，且CRISPR-LICHT能高分辨率地分辨数量较少的不同谱系细胞。172个候选基因中，32个基因gRNA（一个基因的至少2条gRNA）丰度显著降低，其中78%gRNA丰度降低能够被流式细胞手段验证。在25个参与炎症的基因中，大部分与中心粒的生物发生和DNA损伤反应有关，这两种途径都与小头畸形有关。

对中心粒的生物发生和DNA损伤反应有关的基因之外的筛选基因进行分析，发现IER3IP1或参与调控脑增殖的新途径。IER3IP1被预测含有2个腔内连接的内质网跨膜结构域，在病人中，任何一个结构域是纯合突变都导致无功能的蛋白。通过构建3株独立的IER3IP1纯合LOF突变的hESC细胞系，发现IER3IP1 KO类器官比野生型更小，这与病人中表型一致，而重新表达野生型IER3IP1可改善这种缺陷。IER3IP1 KO类器官具有更小的神经花环，表明神经祖细胞的丢失。对WT和IER3IP1 KO细胞在不同时间进行RNA测序分析，发现两者在干细胞多能阶段转录本较为相似，而类器官阶段差异较大。IER3IP1 KO类器官在28天时，神经分化通路的基因呈现富集状态，而细胞分化相关通路基因表达减少；42天时，两者相比没有被下调的通路或重大脑区背侧/腹侧模式上的改变，说明IER3IP1并不参与命运决定。IER3IP1 KO类器官中上调的通路主要参与ER应激压力和UPR，分泌通路和高尔基囊泡运输，即IER3IP1 KO发生ER功能失调相关的转录响应。使用电镜技术观察到ER结构的宽度显著增加，而长度或面积不变，意味着ER应激压力增加。

进一步研究发现，IER3IP1 KO类器官中很多ECM蛋白的转录水平没有变化，但其蛋白水平显著降低。而小鼠中缺失这几种ECM蛋白导致过早分化和神经祖细胞的丢失，以及组织完整性的缺陷，类似于IER3IP1 KO类器官的表型。IER3IP1 KO类器官显示出增殖祖细胞异常定位在心室样增殖性神经花环外，且组织的完整性具有缺陷，即功能正常的ER（包括高效的分泌通路等）同多沉积足量的ECM促进组织完整性和神经祖细胞的增殖，从而帮助正确的大脑发育。进一步研究显示，药物干预上调eIF2B的功能活性显著增加IER3IP1 KO类器官的大小和神经花环的大小，即上调蛋白翻译过程能增加成熟的分泌蛋白的水平，改善小头畸形相关的缺陷。

IER3IP1 KO导致人脑类器官变小

总的来说，研究开发了新型的CRISPR-LICHT技术，为研究异质组织类器官的批量基因筛选提供工具，同时揭示了ER分泌的调节因子IER3IP1通过调节UPR和ECM蛋白分泌，促进组织完整性，IER3IP1功能失调介导小头畸形的病理发生。

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参考文献

1. D. Jayaraman, B.-I. Bae, C. A. Walsh, The Genetics of Primary Microcephaly.Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 19, 177–200 (2018).

2. G. M. Mirzaa, K. J. Millen, A. J. Barkovich, W. B. Dobyns, A. R. Paciorkowski, The Developmental Brain Disorders Database (DBDB): A curated neurogenetics knowledge base with clinical and research applications. Am. J. Med. Genet.164A, 1503–1511 (2014).