科创中国
膜蛋白制备技术开发
发布时间:
2023-10-12
截止日期:2024-10-12
价格 双方协商
地区： 江苏省 苏州市 昆山市
需求方： 阿拉***公司
行业领域
生物与新医药技术
需求背景
为了快速大量获得目标蛋白质，研究者广泛利用基因重组技术，将目标蛋白的基因转入到细菌、酵母或昆虫细胞等表达体系中大量表达，然后进行纯化。但是，向细胞内人工引入外源基因后，表达出的重组蛋白往往会由于表达量太大超过宿主正常代谢水平，缺乏其自然生理条件下折叠所必须的辅助因子和其他折叠环境，从而堆积起来形成无活性的包涵体。包涵体内部形态呈明显的球形，是无规则伸展肽链的聚集体，大部分由重组蛋白质组成，并且通过非共价键作用力相互结合，不溶于水，必须使用变性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）或者盐酸胍才能溶解。而膜蛋白由于结构复杂，包
涵体形成则更为普遍。
膜蛋白的外源表达办法会形成大量的包涵体，从而影响蛋白的产率，对后续研究和生产带来不利影响。为了使包涵体复性，现有的技术主要包括稀释、透析和柱上复性等等。一般做法是使用蛋白裂解液多次清洗包涵体，然后在复性缓冲液中应加入适合的复性试剂，延长复性时间，采用梯度复性，促进蛋白复性效率。复性完毕在低浓度的缓冲液中梯度缓慢透析24~48h，使用超滤管进行超滤或电渗透析去除变性剂，根据试验情况，确保变性剂全部去除。这
些方法往往需要大大增加溶液体积，并且耗时很长。而且现有的技术一般只是简单地除去变性剂，而不是寻找合适的复性条件，很容易重新形成聚集体。并且，不同于普通沉淀在重新溶解后100%保留活性，包涵体的复性水平往往很低。因为，蛋白质沉淀是活性的天然蛋白质之间的作用力形成的，而包涵体是由新合成的肽链在体外折叠形成的中间体聚集物，这些体外折叠中间体并不一定是形成活性高级天然结构的中间体，从天然结构也不能推论出体外折叠中间体的构象。
需解决的主要技术难题
研发一种膜蛋白制备技术，其目的在于高效复性膜蛋白包涵体，获得高纯度、高均一性、并具有活性的目标蛋白。膜蛋白的丰度低、结构复杂，基于膜蛋白的药物发现相对困难。至今，只有1％具有三维结构的蛋白被成功解析。体外纯化和模拟天然构象是靶向膜蛋白的药物筛选与配体相互作用分析的瓶颈。
期望实现的主要技术目标
研发高效制备膜蛋白的方法，实现样品中直接进行膜蛋白包涵体的复性，无需引入任何去垢剂，使获得的膜蛋白能更大程度地保留天然构象，为此后的晶体学和其他相关研究提供有力支持。
采用cell-free蛋白表达和共价固定化亲和色谱技术，构建新的原位合成膜蛋白生物色谱柱。本发明制备的色谱柱首次实现将单一的具有天然四级结构的膜蛋白单向插入键合脂质体的固定相上。
原位合成膜蛋白亲和色谱柱的制备不需要培养细胞或制备重组蛋白；可快速合成单一的、高纯的、含量稳定可控的膜蛋白；且膜蛋白在固定相上可保持天然的跨膜结构和一致的朝向；灵活的cDNA构建为药物结合位点的分析提供了可能性。
原位合成膜蛋白亲和色谱柱可应用于靶向膜蛋白的复杂体系活性成分筛选、配体与膜蛋白特定区域亲和力的测定。
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