科创中国
提高单萜化合物产量的制造工艺再造
发布时间:
2022-10-26
截止日期:2022-12-31
价格 双方协商
地区： 贵州省 贵阳市 观山湖区
需求方： 贵阳***公司
行业领域
生物与新医药技术
需求背景
随着近年来功能基因组学、代谢工程、系统及合成生物学的发展，微生物细胞越来广泛应用于合成天然活性化合物、生物燃料或化学品。为目标产物高效生物合成，通常须要对细胞天生的新陈代谢进行系统重编程，这个过程则需要下调竞争途径等代谢工程策略。往往通过敲除竞争途径关键基因来下调竞争途径，然而必需基因敲除会导致菌株出现营养缺陷或者致死表型，如ERG20、TPI、PYK、PGI等必需基因缺失会导致细胞死亡或者无法在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长。因此采用弱启动子表达必需基因从而通过在转录水平上下调竞争途径的备选策略被广泛应用于代谢工程中，如在利用酿酒酵母合成倍半萜化合物过程中，通过采用弱启动子或环境诱导抑制型启动子表达ERG9(角鲨烯合成酶基因)，能够减弱倍半萜前体物质FPP(法尼烯焦磷酸)流向竞争的甾醇途径，同时还能显著提高倍半萜产量。然而对于一些双功能酶如ERG20p(法尼烯合酶)能催化两步连续反应依次生成GPP(牻牛儿基焦磷酸)和FPP，中间产物GPP会迅速的被ERG20p生成FPP，导致酵母细胞内难以积累GPP。而单萜化合物又是来衍生于GPP，因此仅仅通过采用弱启动子下调表达ERG20虽然降低了转录水平，不仅降低了GPP衍生物单萜产量和细胞的生物量，还无法阻止大量GPP流向FPP。酶的定向进化不仅能显著增加酶蛋白的反应活性，还能改变其特异性或选择性。以双功能酶编码基因ERG20为例，通过对其进行定点突变，使其具有倾向合成GPP的酶活性及降低FPP的合成酶活性，从而显著提高单萜化合物的产量。
需解决的主要技术难题
1、通过游离质粒表达突变基因能在一定程度上实现代谢酶活性调控，但游离质粒表达存在分离不稳定性和结构不稳定性等弊端，影响菌株的稳定性。
2、质粒上的野生型必需基因可能通过同源重组引起回复突变
3、在携带有Cas9基因的突变工程菌株中得到完整的突变菌株
期望实现的主要技术目标
1、能实现快速靶向多个基因并对其进行编辑
2、能够快速对染色体进行无痕定点突变
3、能够利用CRISPR/Cas9系统对表达的两个筛选标记进行无缝剔除
4、菌株基因突变方法能够应用于体内多片段定点整合等遗传操作
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