行业领域

生物与新医药技术

需求描述

1.服务需求背景:

利巴韦林（ribavirin），化学名为1‑β‑D‑呋喃核糖基‑1H‑1,2,4‑三氮唑‑3‑羧酰胺，别名病毒唑，是一种广谱抗病毒药物，对多种DNA和RNA病毒均有显著抑制作用，在抗病毒临床实践中得到广泛应用。

利巴韦林生产方法有化学合成法、发酵法和酶法三类。目前，国内在工业生产上实施的化学合成法占绝大多数，存在副产物多，产率低，操作步骤多，污染严重，成本高等不足。

酶法生产利巴韦林由Witkowski等首创，在上个世纪80、90年代发展起来，随后被广泛应用于利巴韦林的生产，但酶法生产利巴韦林的酶源细胞生产成本较高，必须先经过对菌体进行分离后才能投入到反应中，菌体培养过程与利巴韦林生产过程分为两个阶段，不能实现偶联，且需要维持较高的反应温度。

添加前体物发酵法（日本公开专利17830/1979）具有原料成本低，来源广泛，能耗低，菌体培养与利巴韦林生产的过程同步进行等优点，但是到目前为止，此法产量较低，仍然处于实验室研究阶段，不能投入到工业生产当中，其关键原因在于：由于技术瓶颈，目前的利巴韦林生产菌株不能兼具高效生产核苷和高效表达嘌呤核苷磷酸化酶这两种特点。

2.服务需求具体内容:

1. 一种解淀粉芽孢杆菌添加前体物TCA（1,2,4‑三氮唑‑3‑羧甲酰胺）发酵法生产抗病毒 药物利巴韦林的生产工艺，即利用自行构建的兼具高效生产核苷和高效表达嘌呤核苷磷酸 化酶这两种特点的基因工程菌RBVM（pBSA43‑Bs816PNP）通过发酵过程中添加前体物 TCA实现发酵法生产利巴韦林，具体工艺包括：A.利用分子生物学技术以鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208作为宿主菌构建兼具高 效表达嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）的基因工程菌RBVM（pBSA43‑Bs816PNP）：即利用PCR 技术从枯草芽孢杆菌BS168中扩增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶编码基因pupG，与经过改 造的表达载体pBSA43连接，构建了具有较高表达效率和很高质粒稳定性的分泌型表达载 体pBSA43‑Bs816PNP和工程菌RBVM（pBSA43‑Bs816PNP）；B.工程菌添加前体物发酵：将步骤A中获得的经扩大培养的菌种RBVM （pBSA43‑Bs816PNP）接入发酵培养基进行工程菌添加前体物发酵，发酵培养基中碳源 含量应为8%～12%，氮碳比N:C应介于10：100～15：100之间，无机盐含量应为***%～12%， 发酵培养基的初始***～***，培养温度33℃～35℃，振荡培养或发酵罐培养60～80h，接 种量为5%～10%V/V，发酵过程中，添加氨水调节发酵液的pH值维持在***～***，发酵开 始12‑24h添加TCA。

2. 根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于B步生产利巴韦林发酵采用的培养基： 葡萄糖8%～12%，酵母膏***%～***%，豆浓***%～2%，玉米浆1%～2%，(NH3)2SO4 1%～***%，MgSO4·7H2O ***%～***%，KH2PO4 ***%～***%，FeSO4 2～4mg/L，自来水 96%～98%，发酵pH值控制在***～***，发酵开始12‑24h添加TCA。

3. 根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于B步生产利巴韦林发酵采用的控制工艺： 发酵温度33～35℃，溶氧维持在15～40%，发酵时间为60～80h。

3.具体的服务需求完成后所要达到的标准或效果:

(1) 采用基因工程手段，突破了鸟苷高产和PNPase高效表达无法在同一株菌上得到实现的瓶颈，使PNPase得以在鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208中得到高效表达，并且能很好的分泌到培养基中且保持活性，较改造之前的PNPase活力有大幅度提高

(2) 操作简单，采用传统的发酵工艺、设备使本发明容易实现普及，发酵温度控制在33～35℃，避免为了维持较高的转化温度而消耗额外的能源

(3) 发酵周期短，产量高，经60‑80小时发酵即可在发酵液中检测到较高的利巴韦林含量，目前最高可达27g/L，糖苷转化率35%‑44%

4.发明人

陈宁;马跃超;刘莉;徐庆阳;谢希贤;张成林

联系人：宋巍；刘胜斌

联系电话：022-60600153；022-60600161