行业领域

新材料技术

需求描述

1.服务需求背景:

4-羟基异亮氨酸（4-Hydroxyisoleucine，4-HIL）是一种主要存在于胡芦巴属植物种子中的L-异亮氨酸羟化物。研究表明4-羟基异亮氨酸具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌的活性以及促进肌细胞对血糖吸收、加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用。因此，作为有效预防和治疗糖尿病及肥胖症的理想药物，4-羟基异亮氨酸具有广泛的应用前景和市场需求。

目前已报道的4-羟基异亮氨酸的生产方法包括提取法、化学合成法以及酶法，但仅提取法用于工业化生产。研究表明此方法获得的4-羟基异亮氨酸构型较多，但仅（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸具有上述生物学活性，从而使得该方法存在提取率低（仅为***%）、分离纯化困难、原材料需求量大、成本高等不足。化学法合成4-羟基异亮氨酸的报道较多，但主要是以葡萄糖、薄荷酮或2-甲基乙酰乙酸乙酯为原料经多步化学反应生成，该方法反应条件苛刻、步骤多、分离困难收率低，而且容易造成环境污染。酶法合成是以己醛、α-酮戊二酸化及L-谷氨酸为底物经4-羟基-3-甲基-2-酮基-戊酸醛缩酶和分支链氨基酸氨基转移酶两步催化合成，该方法转化率低且产品中含有大量α-氨基丁酸等副产物。

2.服务需求具体内容:

一种构建权利要求3所述基因工程菌的方法，步骤如下：以权利要求1所述的L-异亮氨酸羟化酶编码基因为模板、以IDO-3和IDO-4为引物，进行PCR扩增；IDO-3：5’-CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3’(SalⅠ)IDO-4：5’-CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’(EcoRⅠ)PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min30个循环，72℃10min1个循环，反应体系为100μL，取10μLPCR产物经***%琼脂糖凝胶电泳检测；将PCR扩增产物经回收后分别经SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，经电泳、切胶回收后连接至表达载体pXMJ19，获得重组质粒，然后将其电转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032细胞中，获得重组菌株。

一种利用权利要求3所述菌株通过微生物转化法生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：（1）种子培养：用接种环将1-2支经新鲜斜面活化的上述基因工程菌，接种至装有100mL种子培养基的1L挡板摇瓶，于32-37℃，200rpm振荡培养6-8h；（2）菌体的发酵培养：以5%-10%接种量将步骤（1）的种子培养物接种至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发罐培养，发酵温度32-37℃，溶氧维持在20-40%，流加浓度为60-80%W/V的葡萄糖溶液，流加25%W/V的氨水调节发酵液pH至***，发酵培养6-12h，按照10%接种量将一级种子液转接入5L自动发酵罐，装液量为3L，溶氧控制在20%-30%，培养温度33℃，pH控制在***左右；（3）向发酵罐中添加等物质的量浓度的L-异亮氨酸和α-酮戊二酸无菌溶液，使其终浓度为***，按步骤（2）继续培养18-24h。

3.具体的服务需求完成后所要达到的标准或效果:

(1)本发明所述的生产方法克服了提取法存在的提取率低（仅为***%）、分离纯化困难、原材料需求量大、成本高等不足；化学合成法反应条件苛刻、步骤多、分离困难收率低，而且容易造成环境污染的问题；以及酶法转化率低且产品中含有大量α-氨基丁酸等副产物的问题，使得发酵液中仅存在（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸一种构型的4-羟基异亮氨酸，并通过L-异亮氨酸羟化酶编码基因过表达的方法进一步提高转化效率，从而达到简化工艺、降低生产成本

(2)以本发明所述的基因工程菌为催化剂，L-异亮氨酸和α-酮戊二酸为底物，利用微生物转化法合成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸，专一性强，转化效率高于75%，工艺简单易可行，成本低廉，适用于（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的绿色制造

4.发明人

陈宁;张成林;谢希贤;徐庆阳;刘淑云;刘远;王鑫鑫

联系人：宋巍；刘胜斌

联系电话：022-60600153；022-60600161