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本发明适用于显微成像领域，提供了一种三维荧光纳米显微成像方法、系统及成像设备，所述方法包括下述步骤：产生激发光；将所述激发光转换为片状激发光束；将所述片状激发光束作用于样品；探测被作用样品层内荧光标记物发射的荧光；横向定位，获取荧光标记物的二维位置；轴向定位，获取荧光标记物的轴向位置；三维重构，结合所述的二维位置和轴向位置获取被作用样品层的三维纳米分辨图像；轴向扫描，获取不同样品层的三维纳米分辨图像；获得完整样品的三维纳米分辨图像。

本发明以片状光束作为激发光，结合轴向扫描，实现了高精度的三维纳米显微成像，适用于生物领域细胞等厚样品的三维显微成像，解决了厚样品内分子定位精度低，样品观测难的问题。

纳米分辨荧光成像可以以纳米级的空间分辨率直观地显示被标记分子在被 标记物内的空间分布，并能用来研究被标记分子之间的相互作用过程，可用于 生物领域研究细胞内DNA、RNA与蛋白质分子之间的相互作用和运动规律。目 前常用的成像方法是利用荧光标记物本身的开关效应来进行定位的显微成像技 术，通过时分复用、质心定位以及图像复合来进行纳米分辨成像，例如，光敏 定位显微(PALM)、随机光学重建显微(STORM)等等，它们在每个时刻获 取稀疏分布的荧光标记物的定位信息，然后将不同时刻获得的定位信息叠加， 最终实现高横向纳米分辨。结合轴向分辨辅助元件或方法，可进行三维纳米显 微成像。

然而，上述方法比较适用于较薄样品的三维显微成像，对于厚度达到一二 十微米甚至更厚的样品，由于探测物镜非焦平面荧光背景噪声的影响，其标记 分子的定位精度较低，无法获取高精度的三维图像。目前，这些方法大都以结 合全内反射荧光显微(TIRF)的方式实现，通过TIRF只激发表面的荧光分子， 从而有效遏制了非焦平面的荧光信号，但TIRF也带来一定的局限性，即这种方 法只局限于样品表面100nm左右范围内的成像，应用范围受到很大限制。因此， 对具有一定厚度的样品进行三维纳米分辨成像时，通常的做法是增大被标记分 子的稀疏程度，单纯依靠轴向分辨以及轴向扫描手段实现三维纳米分辨成像。 但是，不同深度的荧光分子被激发，不仅降低了轴向定位精度，也影响了成像 效率，增加了厚样品观测的难度。

本发明实施例的目的在于提供一种三维荧光纳米显微成像方法，旨在解决 厚样品内分子定位精度低，样品观测难的问题。

1、发明人：于斌, 陈丹妮, 屈军乐, 牛憨笨2、第一发明人简介：于斌， 博士，教授，博士生导师。目前主要从事超分辨显微技术及应用、计算光学成像、定量相位显微成像等方面的研究工作。目前承担国家自然科学基金、广东省自然科学基金、深圳市基础研究等多项科研项目。发表SCI论文70余篇，申请国家发明专利20余项，授权13项。 课题组常年招聘博士后、博士、研究生的研究方向包括但不限于：超分辨显微、荧光寿命显微、纳米尺度单分子示踪、光片显微、自适应光学、超分辨图像重构、计算光学成像、定量相衬成像、光学系统设计等技术的相关方法、系统、算法、生物学应用和关联技术等。

本发明实施例用片状激发光束作用于样品的一薄层，使处于探测层轴向中 心位置的荧光标记物处于稀疏激发状态，远离探测层轴向中心位置的荧光标记 物免于被激发，实现了厚样品的轴向选择性激发，避免了不同层中处于荧光态 的荧光标记物的相互串扰，并降低了非探测层荧光标记物发出的荧光带来的离 焦背景噪声，进而提高了荧光标记物的横向及轴向定位精度；通过轴向扫描获 得不同深度样品层的三维纳米分辨图像，最终实现厚样品的高精度三维荧光纳 米显微成像，使得厚样品的观测更加容易。

一次性转让，转让价格3万元以上。