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本发明适用于显微成像技术领域，提供了一种大景深三维纳米分辨成像方法，包括下述步骤：创建具有双螺旋点扩散函数和离焦光栅多阶成像性质的光学模块；通过光学模块对待测分子进行成像，获得双螺旋图像；通过双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点的位置确定待测分子的横向位置；通过双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心连线的旋转角度及双螺旋旁瓣的中点位置确定待测分子的轴向位置。

本发明将双螺旋点扩散函数及离焦光栅多阶成像的双重效应相结合，既扩大了景深，又提高了分辨率，该方法可用于完整细胞内任意深度亚细胞的动态范围成像，可获得多个运动分子的动态功能图像，对于在更高水平上认识亚细胞结构与细胞功能变化的关系和规律具有重要意义。

近年来，远场纳米分辨荧光显微成像技术取得了较大的发展。目前最为突 出的方法有两种，一种是基于缩小有效激发光斑，通过直接减小点扩展函数的 半高宽来提高分辨率，包括STED，GSD等；另一种则是基于单分子定位技术， 包括STORM，PALM等。前者是通过受激态或基态耗尽的方式，压缩荧光有 效发射区域；后者则是利用荧光标记本身的开关效应，通过稀疏激发、分时成 像、质心定位以及图像合成来实现纳米分辨成像，已经实现20nm的横向空间 分辨率。

然而，利用单分子定位技术对直径为10μm以上的细胞进行纳米分辨三维 成像仍然存在很多问题。首先，单分子定位对于轴向分辨率并没有提高，常常 需要结合某些改进轴向分辨率的方法，如柱面镜像散法、双螺旋点扩散函数法 （DH-PSF）、双层平面探测法、虚拟空间超分辨显微术（VVSRM）等，可实现 横向空间分辨率达20-30nm左右，轴向分辨率达40-70nm的三维成像，目前， 这些方法的成像深度只有2μm。另外，干涉光敏定位显微技术（iPALM)可将三 维的分辨率提高到20nm以内，但成像范围仅被限制在盖玻片以下500nm的深 度范围内，因此，这些方法的成像深度均较小。

细胞内动态成像要实现细胞内同时追踪多个分子，这要求成像手段在三维 空间以纳米定位精度快速探测十几微米景深范围内的多个目标分子。目前的单 分子追踪(SPT)方法，既可以对样品中只包含目标分子的区域进行局部探测，实 现1nm精度的荧光成像（FIONA）；也可以采用宽场成像的方法，实现同时追 踪多个分子。虽然宽场探测的SPT方法已经发展了图像堆栈、离焦成像、用聚 焦激光光束环绕粒子运动、Fresnel粒子追踪(FPT)，以及柱面镜像散等多种轴 向分辨的方法，已经可以实现三维的纳米定位，但目前实现的成像深度仅仅为 3μm左右，而一般完整细胞的厚度有十几微米，因此，现有的方法仍不能满足 细胞内多分子追踪的大景深要求。

本发明的目的在于提供一种大景深三维纳米分辨成像方法，旨在解决传统 方法成像深度小，难以满足分子定位的大景深要求的问题。

1、发明人：于斌, 陈丹妮, 牛憨笨, 李恒2、第一发明人简介：于斌， 博士，教授，博士生导师。目前主要从事超分辨显微技术及应用、计算光学成像、定量相位显微成像等方面的研究工作。目前承担国家自然科学基金、广东省自然科学基金、深圳市基础研究等多项科研项目。发表SCI论文70余篇，申请国家发明专利20余项，授权13项。 ******课题组常年招聘博士后、博士、研究生的研究方向包括但不限于：超分辨显微、荧光寿命显微、纳米尺度单分子示踪、光片显微、自适应光学、超分辨图像重构、计算光学成像、定量相衬成像、光学系统设计等技术的相关方法、系统、算法、生物学应用和关联技术等。

本发明创建了综合双螺旋点扩散函数及离焦光栅多阶成像双重效应的光学 模块，多阶成像的景深较大，双螺旋成像的分辨率较高且具有一定的景深，通 过上述光学模块成像时，一方面通过多阶成像和双螺旋成像大幅度扩大了景深，另一方面通过双螺旋成像显著的提高了分辨率，本发明的成像景深可达十几微米，既可用于完整细胞内任意深度亚细胞的动态范围成像，又可获得多个运动分子的动态功能图像，对于在更高水平上认识亚细胞结构与细胞功能变化的关系和规律具有重要意义。

一次性转让，转让价格5万元。