本发明公开了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法。本发明属于植物基因工程技术领域，具体提供了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，在本方案中通过将目的基因构建至TRV2载体，重组载体转化农杆菌后，对包含目的基因的农杆菌扩大培养，离心后将菌体重悬，分别以真空抽滤花瓣盘和花苞注射菌液的方法侵染花瓣色斑或花苞。经过两种方法侵染过的紫斑牡丹花瓣色斑可以观察到明显的表型效果，经HPLC检测可发现花色苷含量的显著下降。对花苞注射菌液后的花瓣材料进行结构基因的实时荧光定量检测实时荧光定量，发现目的基因的表达被有效抑制。本发明为紫斑牡丹花瓣基部色斑形成相关基因的功能研究提供一种效果显著、高效快捷的侵染方法。

针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，通过本方案中提供的方法可以高效地使TRV病毒载体浸染发育中的紫斑牡丹花瓣色斑部位，并产生明显表型。本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，具体包括下述步骤：1)将TRV1病毒载体、TRV2空载体和携带目的基因的TRV2重组载体分别转化农杆菌，对鉴定后的阳性农杆菌进行扩大培养，离心后用侵染缓冲液重悬，得混合菌液；2)采用真空抽滤花瓣盘法或者花苞注射菌液法对紫斑牡丹花瓣或花苞进行侵染，并观察表型。进一步地，步骤2)中采用真空抽滤花瓣盘法进行侵染的具体步骤为：(1)用打孔器将花瓣色斑部位取下，置于混合菌液中；(2)用真空泵抽真空至0.7atm，负压处理45min，辅助混合菌液侵染花瓣；(3)真空抽滤侵染后的花瓣盘放入干净的培养皿中，喷施清水使花瓣盘保持湿润，置于阴凉处48h后观察表型，并保存样品用于HPLC检测花色苷含量变化。

紫斑牡丹(Paeonia rockii)是我国牡丹野生种之一，因其纯白色花瓣的基部有一个深紫色斑点而得名。作为牡丹野生种中最濒危的种类，紫斑牡丹是牡丹色斑品种的主要遗传来源，但其花瓣基部色斑形成的分子机制仍不清楚。紫斑牡丹从实生苗到开花需要经历3～4年的时间且实生苗性状变异较大。目前通过转基因技术在本源植物上来验证紫斑牡丹基因的功能，存在一定的技术瓶颈，紫斑牡丹再生及遗传转化较为困难，且尚无稳定转化体系。病毒诱导的基因沉默避免了植物转化的需要，方法简单，结果迅速。

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是利用植物抗病毒防御机制作为植物反向遗传学工具的技术，将携带植物功能基因cDNA的病毒侵染植物，引起基因沉默和表型变异，通过表型变异进行基因功能分析的方法。

VIGS的作用机制是：病毒侵染植物细胞引起双链RNA的积累，双链RNA在植物体内被Dicer酶降解成小分子干扰RNA(siRNA)，siRNA与RNAase结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，RISC特异性地攻击同源mRNA导致其降解，进而达到基因沉默的目的。

烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体是VIGS技术用于植物基因功能研究的优选载体，是从TRV基因组发展的一种VIGS载体，侵染效率和持久性较好，能够介导基因沉默的同时不会带来病毒诱导的症状，因而应用广泛。RNA1和RNA2 cDNA的双元表达载体TRV1和TRV2是植物VIGS常用沉默载体。TRV2用于携带目的基因，TRV1负责辅助病毒载体，增强侵染效率。

目前关于VIGS技术在紫斑牡丹花瓣基部色斑形成过程中相关基因功能验证的报道还未发现。

西北农林科技大学地处中华农耕文明发祥地、国家级农业高新技术产业示范区——陕西杨凌，是教育部直属、国家“985工程”和“211工程”重点建设高校，首批入选国家“世界一流大学和一流学科”建设高校，2022年入选国家第二轮“双一流”建设高校，2个学科入选“双一流”建设学科。

具有下述优点：

(1)采用真空抽滤花瓣盘的方法，采样后可在实验室进行，方便观察。

(2)采用花苞注射菌液的方法，利用带针头的注射器将菌液侵染入花苞，无需稳定转化和无菌操作即可验证目的基因在花瓣基部花青苷合成中的作用。

本方案中提供的上述两种方法均可以高效地使TRV病毒载体浸染发育中的紫斑牡丹花瓣基部，并产生明显表型。本发明为病毒诱导基因沉默技术在紫斑牡丹花瓣基部色斑形成过程中花青苷相关基因的功能研究提供了两种快捷高效的验证方法。对研究紫斑牡丹花瓣色斑形成机理提供了新的思路。

技术转让，许可，合作所需资金需双方协商，希望具备此项技术研发的技术方，能够承接此项目。