本发明提供了一种可同时检测牛轮状病毒(BRV)和产肠毒大肠杆菌(ETEC)的可视化多重荧光LAMP检测方法。本发明在LAMP方法中引入了两个荧光基团,通过反应产物颜色直接判断结果,例如红色即为牛轮轮状病毒(BRV)引起的牛腹泻,绿色即为产肠毒大肠杆菌(ETEC)引起的牛腹泻。

本发明提供的检测方法通过一个反应管中的一次LAMP反应,即可同时鉴别检测两个病毒。本发明设计的引物序列灵敏度高,每个反应最低能检测到100个拷贝混合模板；特异性好,能高效扩增目的基因；临床检测效果好。本发明提供的检测方法,方便、快速、无需使用昂贵仪器、成本低,能够实现现场检测病原。

犊牛腹泻症是养牛业的一种常见病，在犊牛出生一个月内其发生率和死亡率最高，给养牛业造成巨大的经济损失。牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)和产肠毒大肠杆菌(***,ETEC)是引起犊牛腹泻症的主要病原。牛轮状病毒感染所引起的腹泻多发生在1月龄以内的犊牛，引起疾病的严重程度差别很大，包括无症状感染、温和的自限性腹泻以及伴有严重脱水的重度腹泻。据报道将近一半的新生犊牛腹泻与轮状病毒感染有关。据资料显示,轮状病毒引起犊牛腹泻的发病率为60％～80％,死亡率为0～50％。产肠毒大肠杆菌能产生肠毒素，导致宿主分泌型腹泻症。已经鉴定出几种类型的肠毒素：不耐热型(LTⅠ，LTⅡ)和耐热型(STa，STb)，导致新生犊牛腹泻症。因为肠毒素不具有免疫原性，所以在犊牛中控制ETEC主要是诱导抗体抑制菌毛蛋白。犊牛的F4(LTⅠ),F5(STa)抗原是最常见的两种抗原，可作为诊断和制备疫苗之用。通常1-7日龄犊牛容易感染BRV，期间感染引起的肠细胞损伤更利于ETEC的附着和感染，表现为严重腹泻，腹部扩张，脱水，休克，发病快，死亡率高。只根据临床症状，很难区分ETEC和BRV，且这两种细菌和病毒经常混合感染，临床上很容易误诊，所以常常因为不能得到及时正确的诊断和有效的治疗，而造成很大的经济损失。因此急需开发ETEC和BRV的快速检测相关产品和方法，对犊牛腹泻症的防治提供技术保障。

谢芝勋(1963.1一)，男，广西博白人。1983年毕业于广西农学院畜牧兽医系兽医专业。二级研究员，硕士研究生导师，现任广西壮族自治区兽医研究所副所长，国家“万人计划”领军人才、“新世纪百千万人才工程”国家级人选、享受国务院特殊津贴专家、广西特聘专家和广西优秀专家。主要从事动物传染病综合防控技术的研究，开展了一系列高水平科研项目的研究工作，先后主持了国家自然科学基金、国家科技成果转化项目、科技部、农业部、广西科技攻关重大专项和广西自然科学基金重点项目等30多个项目的研究，在动物传染病(包括禽病、猪病、牛病、虾病和贝类疾病等)防控技术的研发上取得一批具有国内领先和国际先进水平的科研成果，解决养殖业发展一系列技术关键问题，促进了行业技术进步，产生了显著经济效益和社会效益。

本发明的有益效果还包括：

1继承了传统LAMP的优点：反应条件要求低，只需一台水浴锅，反应时间短，全程90分钟；灵敏度高，多条引物同进扩增，扩增效率高。

2有效抑制假阳性：由于荧光基团镶嵌在内引物FIP上，扩增过程中比普通引物更需要消耗能量，引物与模板DNA分子碰撞要求高，可以有效抑制假阳性。

3结果准确：近几年来，LAMP与其方便快速的优势受到广泛学者的关注，但也由于其自身技术上的局限，多重LAMP方法一直未有较大的进展。与PCR产物特异性目的条带不同，LAMP产物电泳呈梯状条带，LAMP检测无论是单重还是多重，其颜色变化和沉淀物，阳性结果都是一样，不能确定具体到底是由哪一种阳性反应所引起的结果，因此进行多重区分比较困难。本研究采取的是一种新的技术路线，通过添加荧光基团，用不同颜色的荧光基团显示扩增结果，能准确判断病原。

技术转让，许可，合作所需资金需双方协商，此项技术想尽快落地，希望具备此项技术研发的技术方，能够尽快承接此项目。。