一种耐热木聚糖酶突变体及其应用，涉及基因工程和遗传工程技术领域。本发明以来源于真菌Cladophialophora carrionii的第10家族木聚糖酶CcXyl10B为母本，采用理性设计方法，筛选到突变体V126F、S210P和P243L三个突变体的热稳定性明显提升，且催化活力无明显降低。本发明发现了影响第10家族木聚糖酶热稳定性的三个关键氨基酸残基，对第10家族木聚糖酶热稳定性改良具有重要指导意义，同时本发明为木聚糖酶的产业化生产及其在饲料中的应用提供借鉴。

解决的技术问题：本发明提供一种耐热木聚糖酶突变体及其应用，通过对第10家族木聚糖酶CcXyl10B关键氨基酸位点Val126、S210和P243突变后筛选得到的突变体，具体得到3种热稳定性提高的木聚糖酶突变体，对于应用到饲料和利用生物质降解木聚糖产糖产业中具有广阔的前景。技术方案：一种耐高温木聚糖酶突变体，包括以木聚糖酶CcXyl10B为母本对Val126、S210和P243三个位点突变后得到的三种突变体，命名为CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L；所述CcXyl10B_Val126F的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CcXyl10B_S210P的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CcXyl10B_P243L的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

纤维素、半纤维素和木质素是植物组织的主要组成成分，其总量占自然界中生物量的50％以上。木聚糖作为半纤维素的主要组成成分，其含量仅次于纤维素，约占地球有机碳的1/3。木聚糖的结构比较复杂，主链是由吡喃木糖以β‑1,4‑木糖苷键连接而成，侧链主要包括α‑L‑阿拉伯呋喃糖残基、阿魏酸、香豆酸、O–乙酰基和葡萄糖醛酸残基等，因此木聚糖的水解需要多种酶的共同参与。

木聚糖酶是降解木聚糖大分子的关键酶，其可切割木聚糖主链的β‑1，4‑糖苷键生成寡糖或单糖。木聚糖酶在5、7、8、10、11、16、26、30、43、52和62等11个糖苷水解酶家族(GH)中都有分布，其中GH10和GH11家族的木聚糖酶研究最多，GH10家族木聚糖酶属于(β/α)8筒状结构，其稳定性强且底物谱广。大部分微生物来源的GH10家族木聚糖酶在中温(40～60℃)及微酸性环境下活力较强。木聚糖的应用十分广泛，主要包括动物造纸、饲料、食品、啤酒酿造以及绿色能源等领域。在工业应用中，大多数应用环境都属于高温环境，因此获得热稳定性优良的木聚糖酶对工业生产至关重要。

目前，蛋白质工程在酶分子改良方面应用广泛，即通过对基因或者蛋白本身进行修改或修饰以改变蛋白结构从而实现酶功能的改造。蛋白质工程主要用于酶的热稳定性、催化效率、底物特异性和极端环境耐受性等酶学性质的设计和改造。主要涉及的方法有定向进化、理性设计和半理性设计。其中理性设计是一种快速且有效的改造手段，其常用的方法主要有模块替换和定点突变。如通过该方法，显著提高了Thermoascus aurantiacus来源的木聚糖酶XynA的热稳定性。

此技术是江苏科技大学游帅研发，江苏科技大学注册地位于镇江市梦溪路2号。经营范围包括培养高等学历人才，促进科学技术发展。机械制造、焊接、船舶与海洋工程结构力学、轮机工程学科研究生学历教育船舶专业学科、应用物理学、生物技术、统计学、高分子材料工程、焊接技术与工程、机械电子工程、测控技术与仪器、财务管理、物流管理、公共事业管理本科学历教育相关科学研究、科技服务。

与现有技术相比，此技术产生的有益效果：本发明通过以来源于Cladophialophora carrionii的第10家族木聚糖酶CcXyl10b为母本对Val126、S210和P243位点突变后得到的三种突变体，具体通过构建含有该突变体的重组菌株，诱导培养后筛选出在热稳定性具有大幅度提高的三种木聚糖酶突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L。在热稳定性方面，突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的T50值分别为92℃、85℃和88℃，分别比野生酶CcXyl10B(82℃)提高10℃、3℃和6℃；突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L在90℃下的半衰期(t1/2)分别为27min、15min和13min，分别是野生酶CcXyl10B(8min)的3.4倍、1.9倍和1.6倍；在催化活力方面，突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的比活分别为2150U/mg、2270U/mg和1670U/mg，与野生型CcXyl10B(1860U/mg)相比差距不大；最适pH值和最适温度与野生型基本一致，完全符合饲料生产和生物质降解的要求。相对于盲目筛菌或人工(自然)诱变等手段，理性设计缩短了酶学性质改造时间。因此，将本发明的高比活耐热木聚糖酶突变体应用于饲料添加和利用生物质降解木聚糖产糖产业中，具有广阔的应用前景。

技术转让，许可，合作所需资金需双方协商，此项技术想尽快落地保定，希望具备此项技术研发的技术方，能够尽快承接此项目。。