癌症免疫治疗能激活患者的免疫系统，以防止癌症的免疫逃避，在长期减少癌症转移和复发方面有很大的潜力。与传统的化疗或放疗不同，肿瘤免疫治疗在肿瘤治疗中具有更高的选择性和更低的毒性，同时通过免疫记忆提供了长期的免疫。T细胞可以通过结合肿瘤特异性抗原的双特异性分子来重新定向识别和消除肿瘤。其中由于双特异性T细胞接衔接器(Bispecific T-cell engager，BiTE)利用双特异抗体等生物大分子或材料，同时靶向肿瘤特异性抗原及TCR复合体中CD3，介导杀伤时能够绕过MHC限制选择性杀死肿瘤细胞。其原理是为T细胞增加识别肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen,TAA)的能力，建立人工免疫突触，激活T细胞信号使之分泌穿孔素(Peforin)、颗粒酶(Granzyme)等进入肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡。BiTE本质为一个多肽链，包含两个不同抗体的单链抗体(Singlechain fragment variable,scFv)结构域，其中一个单链抗体结构域用来识别任何T细胞上表达的CD3e，另一个单链抗体用来结合肿瘤细胞表达的肿瘤相关抗原。以博纳吐单抗(Blinatumomab)为代表的双特异T细胞衔接器(Bispecific Tcell Engager,BiTE)在B细胞恶性肿瘤治疗领域表现出显著的疗效。

本发明提供的这种T细胞衔接器通过引入异源二聚体蛋白-蛋白相互作用，使用多组相互正交的异源二聚体蛋白构建灵活的蛋白质骨架，配合单链抗体搭建可调节的双特异及多特异性蛋白复合体结构，作为靶向模块，识别肿瘤表面抗原或免疫细胞表面分子，得到多样化的T细胞衔接器，提供双特异、三特异、四特异靶向的能力，可作为免疫治疗药物应用在肿瘤治疗中，激活T细胞信号通路，在体外与体内对肿瘤生长实现抑制。本发明分别将激活CD28共刺激信号及PD-L1免疫检查点抑制的单链抗体整合到构型中，与现有双特异T细胞衔接器相比更有利于辅助T细胞在体内扩增及克服肿瘤免疫微环境。此外，本发明基于HD元件的非共价相互作用构建T细胞衔接器，可以通过HD单体之间的相互竞争的效应实现T细胞衔接器更换靶点的功能以及关闭靶向能力的功能，这为控制T细胞衔接器的毒性提供了潜在的可能性。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

技术合作

本实施例使用CD19靶点及anti-CD19 scFv测试了双特异T细胞衔接器构型。在HD-A元件的N端连接αCD19 scFv，在HD-A’元件C端连接αCD3scFv，在这两个蛋白C端连接his-tag，利用293细胞分泌并从上清中纯化得到αCD19-A、A’-αCD3以及同时表达αCD19-A/A’-αCD3(I-CD19/CD3)的蛋白产物。使用纯化得到的三种蛋白进行T细胞的激活实验，由图4A中T细胞衔接器作用机制示意图可知，在靶细胞存在的情况下，T细胞衔接器激活T细胞信号通路，表现为IFN-γ等细胞因子的分泌及CD69分子的表达量上调。将三种蛋白产物按照不同浓度加入人外周血淋巴细胞中扩增得到的T细胞与人工构建的CD19+的k562细胞(1：1混合)体系中，蛋白终浓度1nM或20nM，24h后收取上清利用ELISA测试其中IFN-γ的浓度(图4B)，收取24h后细胞并通过流式荧光染色观察表征T细胞激活信号的CD69分子的表达情况(图4C)。使用Jurkat-NFAT报告系统作为T细胞，其他实验条件同上，24h后使用流式分析报告系统NFAT-GFP的荧光信号(图4D)，借此判断T细胞内的NFAT信号通路是否被激活。

将T细胞与K562 CD19+靶细胞按照Effector:Target(E:T)＝1:1混合，加入不同浓度梯度的I-CD19/CD3、αCD19-A、A’-αCD3，介导T细胞杀伤靶细胞，48h后检测靶细胞杀伤比例。如图5所示，I-CD19/CD3在0.1-1nM即表现出了特异性杀伤能力，而其组成部分单独存在时则不能实现杀伤效果。

综上可知，由HD元件作为骨架接口可以使靶向肿瘤细胞的单链抗体和靶向T细胞的单链抗体形成完整的、有活性的T细胞衔接器结构。

由此可知，由HD元件为基础的T细胞衔接器在增加PDL1靶向和CD28靶向后对于体内肿瘤的抑制效果相比于双特异抗体有所增强。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。