科创中国
一种重组腺相关病毒载体组合物、外源基因表达系统及方法
成果类型：: 发明专利
发布时间: 2023-09-11 10:33:25
科技成果产业化落地方案
方案提交机构：天津市滨海新区| 宋学姮 | 2023-09-28 15:52:12
本发明公开一种重组腺相关病毒载体组合物、外源基因表达系统及方法，组合物包括rAAV‑L与rAAV‑R；rAAV‑L基因组包含重组酶识别序列I和至少一个启动子序列，其中启动子序列I位于重组酶识别序列I的一侧，重组酶识别序列I位于启动子序列I的下游；rAAV‑R基因组包含重组酶识别序列II和至少一个目的基因序列，其中目的基因序列I位于重组酶识别序列II的一侧，重组酶识别序列II位于目的基因序列I的上游；重组酶识别序列I和重组酶识别序列II为同一种重组酶的识别序列且方向相同。基于本发明，可实现灵活装载不同的启动子、调控序列及基因片段，达到更便捷地调整表达盒特性、更特异地标记和操控细胞等目的。
1.一种重组腺相关病毒载体组合物，其特征在于，其包括重组腺相关病毒载体rAAV-L与重组腺相关病毒载体rAAV-R；所述rAAV-L基因组包含重组酶识别序列I和至少一个启动子序列，其中一个启动子序列记为启动子序列I，启动子序列I位于重组酶识别序列I的一侧，重组酶识别序列I位于启动子序列I的下游；所述rAAV-R基因组包含重组酶识别序列II和至少一个目的基因序列，其中一个目的基因序列记为目的基因序列I，目的基因序列I位于重组酶识别序列II的一侧，重组酶识别序列II位于目的基因序列I的上游；所述重组酶识别序列I和重组酶识别序列II为同一种重组酶的识别序列且方向相同。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体组合物，其特征在于，所述rAAV-L基因组包含的另一个启动子序列记为启动子序列II，启动子序列II位于重组酶识别序列I的另一侧，重组酶识别序列I位于启动子序列II的下游；所述rAAV-R基因组包含的另一个目的基因序列记为目的基因序列II，目的基因序列II位于重组酶识别序列II的另一侧，重组酶识别序列II位于目的基因序列II的上游。
近年来，神经科学与基因治疗是生命科学的两大重点研究领域，病毒载体工具在这两个领域中扮演着重要的角色。在神经科学中，病毒载体可被用于标记或操控神经细胞，从而探究神经网络的结构与功能；在基因治疗领域，病毒载体常被用于基因编辑或基因递送，从而发展遗传疾病的治疗方法。因此，不断丰富现有病毒工具库对科学研究和疾病治疗均具有重要意义。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体具有基因组结构简单、感染细胞范围广、免疫原性低、表达外源基因时间长等特点，并且已经被广泛用于科学研究。
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与现有方法相比，本发明具有以下优点：
1.本发明中rAAV载体将完整的表达盒分成两部分并构建rAAV-L与rAAV-R库，可通过挑选识别序列对应的任一rAAV-L与任一rAAV-R组合，可在含有重组酶的细胞中构成具有不同特性的表达盒，灵活改变基因表达盒元件，从而达到灵活调整外源基因表达的目的，在一定程度上替代现有的DIO(Double-floxed inversive open-reading-frame)等依赖于重组酶分子开关的策略实现细胞特异靶向的表达。基于此方法，可以实现灵活装载不同的启动子、调控序列及基因片段，达到更便捷地调整表达盒特性、更特异地标记和操控细胞等目的。
2.本发明具有易拓展性，发现的新元件可以扩充至rAAV库中，构建一种新rAAV即可产生多种组合方式。
3.本发明中rAAV载体基因组可使用更大的启动子、调控序列从而提高靶向特异性和效率，单个启动子和调控序列片段大小理论上最大可达单个rAAV的全部容量大小(4.7kb)，这是其他方法所不具备的。
4.本发明中各rAAV载体使用通用的重组序列，不利用目的基因自身重组和mRNA剪接等手段，降低研发成本且避免因为剪接错误产生毒性产物。
5.本发明中rAAV载体基因组利用重组酶进行重组，具有微量高效性。
6.本发明可应用在特异性表达重组酶的转基因细胞、转基因动物上，从而达到选择性地表达基因的目的。
7.本发明在研究组织器官结构与功能、表达蛋白和功能RNA、操控神经系统、基因治疗等相关研究中具有应用价值。
技术合作
活体检测结果如图6所示，对于四组病毒，在vGluT2-Cre转基因小鼠的LH脑区内均有较明显的荧光蛋白表达，而在C57BL/6小鼠的LH脑区内荧光明显较少。在单独注射rAAV-R1、rAAV-R2、rAAV-R3、rAAV-R4的vGluT2-Cre转基因小鼠的LH脑区中，仅有rAAV-R1出现了较明显的荧光，这可能是由于高滴度病毒注射量过大导致的泄露表达。
以上结果表明，作为示例的rAAV-L和rAAV-R可以在重组酶的作用下发生重组反应并且表达目的基因，且当使用合适的策略时，可以较好防止目的基因的泄露表达。因此，构建rAAV-L库与rAAV-R库并灵活组合使用是一种可行的策略。
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