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使用冷冻电子显微镜解析蛋白质结构的方法
成果类型：: 发明专利
发布时间: 2023-09-08 14:32:12
科技成果产业化落地方案
方案提交机构：天津市滨海新区| 宋学姮 | 2023-09-26 11:56:41
本申请提供一种利用冷冻电镜进行蛋白质结构解析的方法，包括：使目标蛋白包含标签；使包含有所述标签的所述目标蛋白与支架蛋白结合以形成所述目标蛋白与所述支架蛋白的复合物；以及使用冷冻电子显微镜进行单粒子成像，以解析与所述支架蛋白复合的所述目标蛋白质结构。所述支架蛋白为链霉亲和素、亲和素或者其衍生物中的任意一种。所述标签用于选择性地与支架蛋白结合。所述标签选自以下组成的组中的一者：生物素标签，其包含生物素；生物素化的蛋白质或多肽标签，其包含蛋白质序列和与所述蛋白质序列共价连接的生物素；链霉菌标签(Strep‑tag)；以及生物素化或链球菌标记的抗体、抗体Fab片段或者单链抗体。
一种利用冷冻电镜进行蛋白质结构解析的方法，包括：
使目标蛋白包含标签；
使包含有所述标签的所述目标蛋白与支架蛋白结合以形成所述目标蛋白与所述支架蛋白的复合物；以及
使用冷冻电子显微镜进行单粒子成像，以解析与所述支架蛋白复合的所述目标蛋白质结构；
其中：
所述支架蛋白为链霉亲和素、亲和素或者其衍生物中的任意一种；
所述标签用于选择性地与支架蛋白结合；并且
所述标签选自以下组成的组中的一者：
生物素标签，其包含生物素；
生物素化的蛋白质或多肽标签，其包含蛋白质序列和与所述蛋白质序列共价连接的生物素；
链霉菌标签(Strep-tag)；以及
生物素化或链球菌标记的抗体、抗体Fab片段或者单链抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
在所述标签为所述生物素标签的情况下，所述使目标蛋白包含标签的步骤包括：
使所述生物素标签包含在非规范氨基酸的侧链中，并将所述非规范氨基酸位点特异性地引入所述目标蛋白的氨基酸序列中；
或者，将所述生物素标签化学连接到氨基酸的特定侧链，并将所述氨基酸位点特异性地引入目标蛋白中；
蛋白质的高分辨率三维结构为了解蛋白质的功能提供了重要信息(Garcia-Nafria等人，2020)。经典的蛋白质结构是使用X射线晶体学和NMR光谱法确定的。根据蛋白质的种类，必须克服不同的障碍才能产生高分辨率的蛋白质结构。在X射线晶体学的情况下，必须生成适当衍射晶体，这需要大量纯化蛋白质。在NMR光谱法的情况中，可以在溶液中研究蛋白质结构，但必须用合适的同位素在主链和侧链中进行标记。这两种结构确定技术都非常耗时并且可能非常昂贵。在确定膜蛋白的三维结构时尤其如此(Li等人，2021)。大约三分之一的人类蛋白质组是膜蛋白。许多膜蛋白对细胞的正常功能或功能障碍起着核心作用。它们的功能失常导致许多严重疾病，因此膜蛋白是大多数现代药物的靶标。它们对现代药物开发的重要性将进一步增加(Sriram和Insel，2018年)。
中国科学院深圳先进技术研究院提升了粤港地区及我国先进制造业和现代服务业的自主创新能力，推动我国自主知识产权新工业的建立，成为国际一流的工业研究院。 深圳先进院目前已初步构建了以科研为主的集科研、教育、产业、资本为一体的微型协同创新生态系统，由九个研究平台，国科大深圳先进技术学院，多个特色产业育成基地、多支产业发展基金、多个具有独立法人资质的新型专业科研机构等组成。开展先进技术研究，促进科技发展。信息、电子、通讯技术研究新材料、新能源技术研究高性能计算、自动化、精密机械研究生物医学与医疗仪器研究相关学历教育、博士后培养与学术交流。
根据本申请实施例的HaloTag-PEG4-生物素配体的优点总结如下：
HaloTag-PEG4-生物素配体的末端-Cl可以在亲核反应中被HaloTag蛋白的Asp106置换，形成稳定的酯键，从而形成生物素化的Halo-Tag。生物素化的Halo-Tag能够将目标蛋白与支架蛋白连接形成蛋白质复合物，该蛋白质复合物适用于进行单粒子cryo-EM以确定目标蛋白的结构。可以改变HaloTag-PEG4-生物素配体中PEG4间隔的长度，以最大限度地减少HaloTag蛋白和链霉亲和素支架蛋白之间的灵活性。
技术合作
图9A显示了链霉亲和素-NK1R-halotag复合物的尺寸排阻层析。图9B显示了链霉抗生物素NK1R-halotag复合物、NK1R-halotag的SDS-PAGE，尺寸排阻层析级分1至级分4(图9A)。体积排阻层析和SDS-PAGE表明形成了链霉亲和素NK1R-halotag复合物。
除非另有说明，否则术语“包括”、“具有”、“包括”和“包含”将被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。尽管已经示出和描述了本发明的特定实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不背离本发明的更广泛方面的情况下进行改变和修改，因此，所附权利要求的目的涵盖了所有落入本发明真正精神和范围内的变化和修改。
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