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基于CRISPR-链取代的等温扩增及检测技术
成果类型：: 发明专利
发布时间: 2023-05-18 11:30:30
科技成果产业化落地方案
方案提交机构：天津市滨海新区| 宋学姮 | 2023-05-23 09:51:09
本发明公开了基于CRISPR‑链取代的等温扩增及检测技术。基于CRISPR‑链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，试剂盒还包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特异性识别目标DNA序列上下游的sgRNA对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与Cas9‑sgRNA复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。该技术操作简单，抗干扰能力强，检测结果准确可靠。
1. 一种基于CRISPR-链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，其特征在 于:试剂盒还包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特异性识别目标DNA序列 上下游的sgRNA对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与Cas9-sgRNA复合体对与 目的基因结合后暴露出的单链区域互补。
2. 根据权利要求1所述的等温扩增试剂盒，其特征在于：核酸酶缺陷的Cas9切口酶为 HNH核酸酶缺陷的Cas9切口酶。
3. 根据权利要求1所述的等温扩增试剂盒，其特征在于：sgRNA对的识别位点分别为目 的序列上游CCN序列3’端的10〜30个核苷酸序列和下游NGG序列5’端的10〜30个核苷酸序 列。
4. 根据权利要求1所述的等温扩增试剂盒，其特征在于:链取代等温扩增试剂的DNA引 物具有如下特征:该引物5’端包含了一个切口酶识别位点，且该位点的酶切位点在其互补 链上；该引物的中段与Cas-sgRNA复合体所识别的靶DNA区域的NGG序列所在链的至少10个 连续核苷酸互补配对。
核酸分子基于其生物特性被视为重要的生物标志物。核酸分子的检测在医学诊 疗、食品安全、公共卫生和社会安全等方面有着广泛的应用。通常，在核酸检测过程中，待检 样品中的靶核酸分子浓度极低，而非靶核酸分子浓度则较高。因此，对待检测样品中的靶核 酸分子特异性扩增是提高核酸检测反应的灵敏度和准确度的常用方法。
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本发明的技术反应条件简单，扩增效率高的特点。由于不依赖于初始退火步骤， 且在整个检测过程中仅需维持同一温度这些特点使得本发明的等温扩增体系无需复杂变 温设备，使得检测反应简单可控，检测成本低。同时，通过和链取代反应结合，本发明的等温 扩增体系可在1-2小时内对极低量的靶DNA (HT16M)完成IO6-IO9倍的扩增。
本发明的技术中，CRISPR-Cas9系统和链取代反应系统对传统的PCR反应抑制剂 不敏感，本发明的等温扩增体系对各种杂质成分具有很好的抗干扰性。
技术合作
利用与实施例2相同的方法，使用实施例2中的SgRNA对h-sgRNA2-UPS和h-sgRNA2-DNS对针对人基因组中的特定区域进行特异性扩增检测。实验结果显示（图5)，大量的细胞破碎后的杂质（污染物），对本发明的基于 CRISPR-Cas9系统的链取代扩增反应的效率及特异性无任何影响。
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