科创中国
一种对基因启动子进行定向进化的方法
成果类型：: 发明专利
发布时间: 2023-05-16 16:51:43
科技成果产业化落地方案
方案提交机构：天津市滨海新区| 宋学姮 | 2023-05-18 09:30:45
本发明提供了一种对基因启动子进行定向进化的方法，该方法包括：用易错PCR技术扩增启动子，获得一组突变频率较高的启动子序列；用DNA改组技术去除有害突变，集合有益突变，获得改组的启动子；重组启动子和半乳糖苷酶基因组成表达盒转化宿主细胞，通过蓝白斑筛选和酶活测定获得目标突变启动子。本发明的方法不需要分析基因启动子的功能区域，成本低，高效快捷，操作简便，成功率高，适合于对大肠杆菌或其他细菌、真菌和哺乳动物细胞的基因启动子定向进化。
1.一种改组后的启动子，其具有‑10序列TATAAA，并且其在‑35和‑10之间插入了一个碱基，使两者之间的距离达到17bp，该改组后的启动子的序列为：GAGCTGTTGACAATTTATCATCGAGCTCGTATAAAGTGCGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCCCACAGGAAACAGAATTCTATG。
启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。原核启动子有三个重要的区域：-10序列、-35序列和两者之间的核苷酸。-10序列即TATA盒，控制转录的起始，-35序列在转录时结合RNA聚合酶，而-10区和-35区之间核苷酸数目的变动也会影响基因转录活性。改造这些控制元件能够改变启动子的效率和性质。
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本发明将DNA改组技术与易错PCR技术有机结合，对大肠杆菌的基因启动子进行定向进化，来高效提高基因启动子的效率和蛋白质的产量。这种方法不需要分析基因启动子的功能区域，成本低，高效快捷，操作简便，成功率高，也适合于其他细菌、真菌和哺乳动物细胞的基因启动子定向进化。
技术合作
据文献报道，拥有共同序列-35和-10以及两者之间为17bp碱基的距离是强启动子的特征(de Boer H A,Comstock L J,***,80:21-25；Jensen P R,***,64(1):82-87)。
如图1所示，改组后的tac启动子相比野生型tac启动子，有更为标准的-10序列TATAAA，其在-35和-10之间插入了一个碱基，使两者之间的距离达到17bp，成为一个典型的强大肠杆菌启动子。因此，它生产的半乳糖苷酶酶活比较高。
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