本发明公开了三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法,属于蛋白质提取领域,本发明以海参体壁为原料,制备海参体壁蛋白粗提液、酸沉淀混合丙酮沉淀蛋白、Sevage除去杂蛋白、硫酸铵沉淀目标蛋白、透析法低温除盐及冷冻干燥,获得纯度较高的主要卵黄蛋白,并通过质谱和电泳技术协同鉴定该蛋白主要卵黄蛋白是一种糖磷脂蛋白。本发明提高了海参的高值化利用,使其蛋白资源得到充分开发利用,为蛋白靶向功能活性研究提供前提基础;全过程实验操作简单,蛋白的提取率和纯度较高,不需要特殊高级仪器辅助,经过三步沉淀分离目标蛋白,单次可获得大量的主要卵黄蛋白,适合大规模和高精度纯度研究;蛋白鉴定特异性强,结果清晰直观,操作简便。

为了解决上述问题，本发明提供了一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，本发明方法采用酸沉淀和有机试剂沉淀协同沉淀以及Sevage试剂和硫酸铵沉淀的三步沉淀法得到了海参体壁主要卵黄蛋白，产率高，纯度高，操作简单，单次可以大量提取，成本低，适合批量生产加工。

具体的，本发明的技术方案为：

一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1)海参体壁预处理：将新鲜海参解剖去除体腔内容物，洗净沥干水分，经匀浆机搅碎，得到海参泥；

步骤2)蛋白粗提取：将步骤(1)得到的海参泥与PBS缓冲液按1：3-5g/mL进行混合，0-10℃浸提12-20h，之后离心，离心后所得的蛋白上清液即为蛋白粗体液，此过程重复2-3次，并合并上清液；

步骤3)三氯乙酸和丙酮混合沉淀：将步骤2)得到的混合上清液在50-70℃下进行浓缩，浓缩至原体积的1/3-1/5，将所得浓缩液边搅拌边加入三氯乙酸，使得三氯乙酸的终浓度为 10％-15％，同时加入浓缩液1-1.5倍体积的丙酮，搅拌均匀后，0-10℃静置3-5h，离心后收集沉淀，此过程重复2～3次，合并沉淀物；

步骤4)用Sevage试剂除去非糖蛋白：将步骤3)得到的沉淀物复溶于8-10倍体积的PBS 缓冲液，调pH至7.2-7.4，所得溶液采用Sevage试剂除去杂蛋白，得到海参体壁主要卵黄蛋白；

步骤5)将步骤4)得到的海参体壁主要卵黄蛋白边搅拌边加入硫酸铵沉淀目标蛋白，使得硫酸铵的终浓度为30％-40％，4-10℃条件下，磁力搅拌器中震荡30-50min，再经离心后，收集所得沉淀；

步骤6)透析除盐：将步骤5)所得沉淀中加入3-5倍体积的PBS缓冲液中复溶，对盐溶液进行透析除盐，透析袋选用分子量为8000-10000Da，透析时间24-36h，即得主要卵黄蛋白溶液；

步骤7)冷冻干燥：将步骤6)中所得的主要卵黄蛋白溶液进行冷冻干燥，得到主要卵黄蛋白干粉。

海参体壁中主要卵黄蛋白是一种糖磷脂蛋白，主要有两种存在形式，分别是低分子量的主要卵黄蛋白和高分子量的主要卵黄蛋白原，主要卵黄蛋白原是合成主要卵黄蛋白的前体物质。海参体壁中的主要卵黄蛋白是以高聚体的形式存在，一般含有较高的分子量。已有研究表明，主要卵黄蛋白与生物体内的氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质等营养和功能物质的转运传递密切相关，而且主要卵黄蛋白可以作为免疫因子抵御外界病原微生物的入侵。因此，如何有效的开发利用主要卵黄蛋白得到了越来越多人的关注。

目前，对主要卵黄蛋白的提取集中于酸沉淀或者有机试剂沉淀的方法，所得主要卵黄蛋白纯度低，结构不完整；而通过离子柱等提纯的主要卵黄蛋白虽然纯度高，但是提取效率低，不适合工业化批量生产。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

学校坚持社会主义办学方向，全面贯彻党的教育方针，依照《江南大学章程》，开展自主办学和现代大学制度建设。学校以“笃学尚行，止于至善”为校训，以“彰显轻工特色，服务国计民生；创新培养模式，造就行业中坚”为办学理念，以建设“世界知名、中国一流、江南风格的研究型大学”为战略目标，深入推进教育教学改革，持续提升办学水平，在人才培养、科学研究、社会服务、文化传承创新、国际交流合作等方面取得长足进步，已逐步建成一所规模结构合理、学科协调发展、教学质量优秀、办学效益显著、社会美誉度高，国内有影响力、国际有知名度的特色鲜明的高水平大学。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

本发明的海参体壁蛋白的提取方法采用了酸沉淀和有机试剂沉淀协同沉淀蛋白的方法，增加了蛋白沉淀速率，提高了主要卵黄蛋白提取率；采用Sevage试剂和硫酸铵沉淀目标蛋白的方法，避免杂质蛋白对主要卵黄蛋白的影响，提高了产品的纯度，使终产品的纯度83％以上；本发明经过三步沉淀(TCA和丙酮协同沉淀，Sevage沉淀和硫酸铵沉淀)的方法所得的主要卵黄蛋白产率高提取率约为海参干重的13.9％，纯度高；另外，对比其他对主要卵黄蛋白沉淀的方法，如过离子柱或者蛋白纯化仪的方法，本发明方法的显著优势是操作简单，单次可以大量提取，成本低，适合批量生产加工；终产品采用透析和冷冻干燥的方式，既可以防止蛋白质变性，又能除去盐离子的影响，得到的产品具有外貌疏松，溶解性好、结构稳定和纯度高等特点。终产品主要卵黄蛋白粉经过不同的染色方法和质谱鉴定，确定主要卵黄蛋白是一种糖磷脂蛋白。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。