本发明公开了一种高效合成丙酮酸与D 丙氨酸的工程菌及其构建方法与应用。本发明在基因工程菌株BLK07(pET20b pm1)的基础上,通过定点饱和突变筛选到了pm1酶活提高的菌株,并通过在pm1基因序列N端插入N端编码序列(NCS),提高了pm1的蛋白表达量,提高了丙酮酸的产量,显著缩短了催化时间,提高了催化效率。当底物D,L 丙氨酸浓度为110g/L,细胞浓度为4g/L,催化体系在摇瓶中37℃、220rpm只催化8h时,丙酮酸的产量即可达到最大值46.5g/L,L 丙氨酸的转化率为84.5%,D/L 丙氨酸的拆分率达到84.5%。

发明通过计算机模拟的分子对接，将L-氨基酸脱氨酶pm1的同源模型的三维蛋白结构和配体L-丙氨酸的三维结构进行分子对接并选取关键位点周围五个位点进行饱和突变。利用2,4-二硝基苯肼显色法对饱和突变菌株进行高通量筛选，获得了催化活力明显提高的BL21(pET20b-pm1-V438I)菌株。

本发明的第一个目的是提供一种高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的工程菌，所述的工程菌是在大肠杆菌宿主中过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-氨基酸脱氨酶，并在编码L-氨基酸脱氨酶的基因序列的N端插入N端编码序列。

丙酮酸(Pyruvic acid)是药物合成领域的重要中间体，广泛应用于食品、农药、生化等工业中。目前工业上丙酮酸的生产方法主要有化学合成法，酶转化法和微生物发酵法。其中，化学合成法成本较高，而且其对于环境的污染较大；而微生物直接发酵法中，产物的成分复杂且分离难度大。生物催化法合成丙酮酸可以克服上述两种方法的不足和缺点，因此，在工业应用中具有广阔前景。

D-丙氨酸是生产维生素B6和泛酸钙的原料，具有镇痛作用，也可用作多种生化试剂和有机合成中间体。目前D-丙氨酸的价格比D,L-丙氨酸、L-丙氨酸都要高，然而D,L-丙氨酸的拆分困难，且成本较高。因此，寻找一种操作简单、成本低且效率高的D,L-丙氨酸的拆分方法很有意义。

L-氨基酸脱氨酶(***)广泛存在于自然界各种生物中。每类L-氨基酸脱氨酶均对特定的一种或几种氨基酸或其氨基酸衍生物表现出较高的底物亲和性，而对其他氨基酸的亲和性较差。因此，不同来源的L-氨基酸脱氨酶具有高度保守性。Proteusmirabilis来源的L-氨基酸脱氨酶pm1，能催化L-丙氨酸生成丙酮酸，却几乎不催化D-丙氨酸，因此pm1可用于手性拆分D,L-丙氨酸。

大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)是一种可用于高效表达含T7启动子的表达载体的菌株，其遗传背景清晰，分子手段多样，是一种被广泛用作异源表达重要化学品合成途径的生产宿主。

分子对接是通过受体的特征以及受体和配体分子之间的相互作用方式来进行药物设计或蛋白分析的方法。主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。近年来,分子对接方法已成为计算机辅助酶蛋白研究领域的一项重要技术。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明通过定点饱和突变筛选到了pm1酶活提高的菌株，通过在pm1基因序列N端插入N端编码序列(NCS)，提高了pm1的蛋白表达量，并缩短了催化时间。当底物D,L-丙氨酸的浓度为110g/L，细胞浓度为4g/L，催化体系在摇瓶中37℃、220rpm催化8h时丙酮酸的产量达到最大值46.5g/L，L-丙氨酸的转化率为84.5％，D/L-丙氨酸的拆分率达到84.5％。

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