本发明公开了一种结合多种内标对样本中真菌进行绝对定量的方法,属于生物工程技术领域。本发明提供了可用于对样本中真菌进行绝对定量的混合内标质粒,将此混合内标质粒以1×107copies/g的浓度添加至待测样本中作为内标质粒后,可以待测样本中内标质粒Ⅰ~Ⅴ的浓度为依据,直接计算得到各真菌在待测样本中的浓度,避免了微生物计数的步骤,操作更为简便。并且,由于此混合内标质粒含有的内标质粒Ⅰ~Ⅴ分别含有不同长度和不同GC含量的内标DNA片段Ⅰ~Ⅴ,并且,将此混合内标质粒添加至待测样本中后,对待测样本的真菌菌群结构几乎没有影响,因此,使用此混合内标质粒对样本中真菌进行绝对定量的准确性较高。

本发明提供了一种可用于检测样本中真菌绝对含量的混合内标质粒，所述混合内标质粒含有内标质粒Ⅰ～Ⅴ；所述内标质粒Ⅰ～Ⅴ分别含有内标DNA片段Ⅰ～Ⅴ；所述内标DNA片段Ⅰ～Ⅴ分别由核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的DNA片段、填充序列、核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示的特异性DNA片段、填充序列以及核苷酸序列如SEQID NO.40所示的DNA片段依次连接而成，其中，内标DNA片段Ⅰ的大小为272bp、GC含量为40％，内标DNA片段Ⅱ的大小为272bp、GC含量为40％，内标DNA片段Ⅲ的大小为325bp、GC含量为40％，内标DNA片段Ⅳ的大小为325bp、GC含量为60％，内标DNA片段Ⅴ的大小为387bp、GC含量为40％。

本发明提供了可用于对样本中真菌进行绝对定量的混合内标质粒，以内标质粒Ⅱ为例，通过内标质粒Ⅱ为与待测样本混合物的基因组DNA的高通量测序的结果，将内标质粒Ⅱ占混合物中重组质粒与真菌总数量的比例(即重组质粒在混合物中的相对丰度)与其对应的初始添加浓度的LG值建立回归方程，结果两者具有很好的线性关系(R2＝0.99)，表明内标质粒Ⅱ能对应地在高通量测序结果中被反映出，从而能对其他种类真菌的绝对含量进行较为准确地评估；以内标质粒Ⅱ为例，通过以含有不同浓度内标质粒Ⅱ的混合物基因组DNA为模板得到的熔解曲线一致，具有一致的DNA熔解温度，说明内标质粒Ⅱ携带的扩增基因在复杂样本中同样具有较高的特异性，因此，使用此混合内标质粒对样本中真菌进行绝对定量的准确性较高。

真菌是一种具真核的、产孢的、无叶绿体的真核生物，包含霉菌、酵母、块菌以及其他人类所熟知的菌菇类。目前，已经发现了十二万多种真菌。

研究证明，真菌菌群在各个领域均具有重要作用，例如，人类健康领域、植物生产领域、养分循环领域以及食品发酵领域。并且，研究证明，真菌菌群的菌种数量以及每种菌的丰度对真菌菌群的在各个领域的应用效果有很大的影响，例如，酿酒所使用的大曲中的真菌数量以及每种菌的丰度会直接影响酒的口味和香气。因此，准确分析真菌菌群中的真菌数量以及每种菌的丰度对真菌菌群应用的进一步发展十分重要。

高通量测序的发展带来了许多有关真菌分类学和相对丰度的信息。然而，相对丰度不能反映真菌菌群的数量和样品之间的差异。当不同样品中的微生物总量不一致时，相对丰度比较可能得出错误的结论。因此，为了揭示不同样品中真菌的真正复杂性，必须对真菌菌群进行定量表征。

杨黎设计含有三域(真菌、细菌、古菌)的序列克隆到质粒中导入菌株，以此作为内标菌株加入土壤，通用高通量测序进行土壤中微生物的定量。但是，此方法直接以菌株作为内标，而加入土壤的菌株无法实现准确的定量，会造成极大的误差，准确性低。并且，三域内标菌株中的16S及ITS基因片段大小与土壤微生物的平均16S及ITS基因片段大小差异较大，而有研究表明，在高通量测序技术的微乳液PCR中，同一对引物对长度较短的片段的扩增具有一定偏好性，从而影响了长片段的扩增效率，造成准确性低下(具体可见参考文献：杨黎.土壤微生物群落高通量绝对定量方法建立及其应用[D].浙江大学,2018.)。

因此，急需找到一种准确度更高的对样本中真菌进行绝对定量的方法。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

(1)本发明提供了可用于对样本中真菌进行绝对定量的混合内标质粒，混合内标质粒含有内标质粒Ⅰ～Ⅴ，内标质粒Ⅰ～Ⅴ分别含有内标DNA片段Ⅰ～Ⅴ，内标DNA片段Ⅰ～Ⅴ分别由核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的DNA片段、填充序列、核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示的特异性DNA片段、填充序列以及核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示的DNA片段依次连接而成，其中，内标DNA片段Ⅰ的大小为272bp、GC含量为40％，内标DNA片段Ⅱ的大小为272bp、GC含量为40％，内标DNA片段Ⅲ的大小为325bp、GC含量为40％，内标DNA片段Ⅳ的大小为325bp、GC含量为60％，内标DNA片段Ⅴ的大小为387bp、GC含量为40％；以内标质粒Ⅱ为例，将内标质粒Ⅱ以1×106～1×1011copies/mL的浓度添加至待测样本中时，提取效率高达17.42～18.71％，因此，本发明的混合内标质粒稳定性高。

(2)本发明提供了可用于对样本中真菌进行绝对定量的混合内标质粒，将此混合内标质粒以1×107copies/g的浓度添加至待测样本中作为内标质粒后，可以待测样本中内标质粒Ⅰ～Ⅴ的浓度为依据，直接计算得到各真菌在待测样本中的浓度，避免了微生物计数的步骤，操作更为简便。

(3)本发明提供了可用于对样本中真菌进行绝对定量的混合内标质粒，由于此混合内标质粒含有的内标质粒Ⅰ～Ⅴ分别含有不同长度和不同GC含量的内标DNA片段Ⅰ～Ⅴ，并且，将此混合内标质粒添加至待测样本中后，对待测样本的真菌菌群结构几乎没有影响，因此，使用此混合内标质粒对样本中真菌进行绝对定量的准确性较高。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。