本发明公开了催化活性提高的黄酮3β 羟化酶突变体及其应用,属于基因工程技术领域。本发明通过对水飞蓟来源的黄酮3β 羟化酶进行突变,并筛选获得了使圣草酚产量提高的黄酮3β 羟化酶突变体。将黄酮3β 羟化酶突变体应用于圣草酚的生产中,可使得圣草酚的产量在摇瓶水平由出发菌株的805.6mg/L,分别提高到1017.8mg/L和1046.5mg/L,分别较原始黄酮3β 羟化酶的产量提高26.3%和29.9%。

本发明中出发基因为来源于水飞蓟的黄酮3β-羟化酶SmF3′H，因为SmF3′H的结构未知，通过理性改造进一步提高SmF3′H的酶活比较困难，为进一步提高圣草酚的合成，可以利用定向进化技术获得酶活提高的SmF3′H突变子，以及相应的高产圣草酚菌株，这对实现工业化微生物法生产圣草酚具有十分重要的意义。

本发明的第一个目的是提供黄酮3β-羟化酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄酮3β-羟化酶为亲本，分别将亲本第344位，或第285位的氨基酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第344位氨基酸突变为丝氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第285位氨基酸突变为天冬酰胺，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示黄酮3β-羟化酶突变体的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的黄酮3β-羟化酶突变体的编码基因序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第三个目的是提供携带编码所述突变体的基因的载体。

圣草酚(Eriodictyol)是一种重要的黄酮类化合物，对人体具有多种益处，如抗炎、抗衰老、抗氧化等作用，广泛应用于食品添加剂。同时也是多种高附加值化合物的前体，如黄杉素、花青素、水飞蓟及大风子素等。圣草酚主要来自于植物提取法，然而植物提取法有许多缺点，如需要高温、提取时间长、需要大量有机试剂等。而使用微生物法生产黄酮类化合物具有较高的潜力。

柚皮素(Naringenin)经过F3′H催化，可以在柚皮素3′引入羟基，从而获得圣草酚。由于F3′H属于P450酶(Cytochrome P450)，因此需要辅酶CPR辅助获得电子才具有催化功能，因此F3′H需要与CPR共表达才具有较好的催化功能。但是只有较少的F3′H及其辅酶CPR的催化功能被很好的验证，此外，由于F3′H/CPR需要锚定在内质网上才可以高效传递电子(图1)，因此大部分的F3′H/CPR在原核微生物中表达活性很低甚至没有活性。由于缺乏高效的F3′H/CPR，对F3′H/CPR表达模式的研究也较少，无法进一步对F3′H/CPR的表达强度进一步提高，目前已报道的使用F3′H催化柚皮素获得圣草酚的最高产量仅200mg/L(Amor,I.L.,et al.,Biotransformation of naringenin to eriodictyol by Saccharomycescerevisiea functionally expressing flavonoid3'***,2010.5(12):p.1893–1898.)。在大肠杆菌中合成圣草酚的产量最高仅107mg/L(Zhu,S.,etal.,Efficient synthesis of eriodictyol from L-***,2014.80(10):p.3072–3080.)。

目前利用微生物法生产圣草酚的转化效率和产量都很低，限制了其在实际生产中的应用。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

有益效果：本发明通过对水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶进行突变，通过高通量的筛选方法，筛选到了能够使得圣草酚产量提高的黄酮3β-羟化酶突变体。在酿酒酵母中表达SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的编码黄酮3β-羟化酶突变体的基因，使黄酮3β-羟化酶催化柚皮素产圣草酚的能力提高，圣草酚产量由805.6mg/L分别提高至1017.8mg/L和1046.5mg/L，圣草酚的产量分别增加了26.3％和29.9％。通过将最佳突变体进行组合，在发酵罐水平首次获得了克级别的圣草酚积累，达到3.28g/L，是已报道最高产量的16.4倍。

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