本发明提供了一种制备蛋白酶筛选底物的方法，所述方法为将含有蛋白和金纳米颗粒的缓冲液进行第一次反应，得到反应液A；在反应液A中添加巯基己醇进行第二次反应，得到反应液B；将反应液B进行分离，得到蛋白酶筛选底物。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液中，蛋白的浓度为5~100 mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液中，蛋白的浓度为40 mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白为大米蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液中，金纳米颗粒的浓度为0.1~1.0 mmol/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液中，金纳米颗粒的浓度为0.1 mmol/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、Tris-EDTA缓冲液或Tris缓冲液。

本发明提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，所述方法为将待测样品与上述蛋白酶筛选底物混合，若混合液颜色不发生变化，则待测样品的蛋白酶酶活为0或低于检出限；若混合液由酒红色变为橘色，根据公式Y=-0.1527X+31.82计算待测样品的蛋白酶酶活；所述公式中，Y为颜色变化的响应时间，单位为s，X为酶活，单位为U/mL。

本发明提供了上述制备蛋白酶筛选底物的方法或上述蛋白酶筛选底物或上述测定蛋白酶酶活的方法在测定蛋白酶活性或筛选不同酶活的蛋白酶中的应用。

大米是我国第一大粮食品种。大米蛋白则是国际公认的优质蛋白。与大豆蛋白、乳清蛋白等蛋白相比，大米蛋白的营养抑制因子含量少，无过敏反应，大米蛋白包含人体所需氨基酸且氨基酸配比合理，另外，大米蛋白的生物价远超大豆蛋白，可与虾及牛肉等的生物价相媲美，符合世界卫生组织（WHO）推荐的理想模式。

但是，由于大米蛋白中含有较多谷蛋白，不易溶解，因此，大米蛋白多用作动物饲料添加剂。为了提高大米蛋白的附加值，通常将其水解成短肽或氨基酸后制成营养价值更高的短肽或氨基酸营养液，作为高价值添加剂运用于保健品、饮料、化妆品等行业。高纯度的大米肽价格在10万/吨以上。

目前，主要是使用酶解法对大米蛋白进行水解。但是，现有的酶解法仍具有许多缺陷，其中，酶解法所使用的蛋白酶对大米蛋白的酶活不高所导致的水解大米蛋白效率低、水解大米蛋白所得水解液中多肽含量低是最严重的缺陷之一。例如，公开号为CN1102229643A的专利申请文本中，发明人使用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶三种酶复配水解大米蛋白，水解3h，仅可使反应液中多肽的含量达50%左右；公开号为CN106967773A的专利申请文本中，发明人使用亮氨酸氨肽酶水解大米蛋白，水解4 h，仅可使反应液中多肽的含量达30%~40%。因此，筛选得到更多对大米蛋白酶活高的蛋白酶至关重要。

福林酚法（中华人民共和国专业标准GB/T 23527-2009：蛋白酶制剂）是目前测定蛋白酶酶活最常用的方法，利用此方法，可分别以酪蛋白、大米蛋白等多种蛋白为底物测定蛋白酶对不同蛋白的酶活。但是，福林酚法具有操作繁琐、耗时耗力等缺陷，这大大降低了蛋白酶酶活的检测效率。因此，急需找到一种操作简单的测定蛋白酶酶活的方法，尤其是以大米蛋白为底物测定蛋白酶酶活的方法。

发明人：吴敬 颜正飞 秦琴 唐诚业

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

（1）本发明提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，利用此方法检测蛋白酶的酶活时，仅需将待测样品与蛋白酶筛选底物混合后观察混合液的颜色变化和颜色变化的响应时间即可，操作简单。

（2）本发明提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，此方法以大米蛋白为底物，因此，利用此方法可准确的测定出蛋白酶对大米蛋白的酶活，在筛选得到更多对大米蛋白酶活高的蛋白酶方面具有极高的应用前景。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。