为解决上述问题，本发明基于褐藻胶裂解酶的结构推测，采用结构序列分析方法，确定对催化域附近的loop区域进行改造，并通过定点突变和组合突变进行改造，得到对PolyG片段具有较高的降解能力的突变体。该突变体底物偏好性变化明显，同时其催化活性和稳定性也有一定程度的提高，为其进一步的应用奠定基础。

本发明的第一个目的是提供一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体，所述的突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶为亲本，将亲本褐藻胶裂解酶氨基酸序列201～211位loop区域进行定点突变。

进一步地，所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶亲本的205位甘氨酸突变为酪氨酸。

进一步地，所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶亲本的210位天冬酰胺突变为酪氨酸。

进一步地，所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶亲本的205位甘氨酸突变为酪氨酸，以及210位天冬酰胺突变为酪氨酸。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的褐藻胶裂解酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述的褐藻胶裂解酶突变体的重组菌。

进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。

本发明的第三个目的是提供所述褐藻胶裂解酶突变体在医药、农业、印染、化工、防治等行业中的应用。

进一步地，所述的应用是采用褐藻胶裂解酶突变体降解褐藻胶为褐藻寡糖。

褐藻是三大藻类之一，主要成分为褐藻胶、甘露醇和海带多糖。其中，甘露醇和海带多糖的利用的相关研究较为成熟，因此，如何高效降解褐藻胶并实现工业化应用是目前研究的热点。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)构成的线性多糖，其降解产物褐藻寡糖具有重要的生理活性，如抗氧化、抗肿瘤、促进植物根细胞生长等，因此受到了广泛的关注。

目前，制备褐藻寡糖的方法主要是酸解等化学法，制备条件剧烈且容易造成环境污染，而相比之下，生物法降解褐藻多糖条件温和、易于控制并且绿色环保，因此开发高效、稳定性高且易于制备的褐藻胶裂解酶是十分必要的。

褐藻胶裂解酶(Aly)可以通过β-消除反应机制来降解褐藻胶，并且在降解产物的非还原端形成不饱和的碳碳双键，形成末端不饱和双键结构的降解片段。根据其酶切方式，可将其分为内切型(endo-type)和外切型(exo-type)褐藻胶裂解酶，内切型Aly降解褐藻胶的终产物为褐藻寡糖(AOs)，常见产物聚合度为2-6，而外切型Aly的产物单一，终产物主要为单糖。在应用上，内切型的褐藻胶裂解酶更具有研究和应用价值。根据Aly的底物特异性，可将其分为专一降解甘露糖醛酸片段(PolyM)的酶，专一降解古罗糖醛酸片段(PolyG)的酶以及两种片段都可裂解的双功能裂解酶。目前公开报道的褐藻胶裂解酶中，以能降解PolyM的酶以及双功能酶居多，高效降解PolyG片段的酶较少。但由于PolyG片段较大的刚性使得其来源藻类的难以充分降解，因此可高效降解PolyG片段的酶研究具有重要的研究意义。

目前的研究表明，基因工程是提高褐藻胶裂解酶酶活的主要手段。常规的提高重组蛋白表达水平的方法往往是基于一级氨基酸序列的改造，包括催化关键位点的突变、启动子更换、高分泌能力强的信号肽替换等。但这种改造方法往往存在效果不确定性，需要大量实验工作量。基于更高级的蛋白结构的改造方法更具有针对性和优势。

发明人：李恒 史劲松 李星霖 吴雯 龚劲松 许正宏

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明基于褐藻胶裂解酶的结构推测，采用结构序列分析方法，确定对催化域附近的loop区域进行改造，并通过定点突变和组合突变进行改造，得到对PolyG片段具有较高的降解能力的突变体；将亲本褐藻胶裂解酶氨基酸序列中位于催化域附近的loop区205位、210位突变为酪氨酸，将褐藻胶裂解酶对底物的偏好性由M转变为G，酶活6100U/mL，稳定性得以提高。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。