本发明公开了一种能降解黄曲霉毒素B1的锰过氧化物酶,属于生物技术和基因工程技术领域。本发明发现一种来源Phanerochaete chrysosporium的锰过氧化物酶具有降解黄曲霉毒素B1的功能,并且用一个食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母GG799和食品安全级质粒pKLAC1实现了Phanerochaete chrysosporium来源的锰过氧化物酶的重组表达。构建得到的重组菌的表达产物具有降解黄曲霉毒素B1的作用,且降解率可达到75.7%。本发明为来源Phanerochaete chrysosporium的锰过氧化物酶后续的蛋白质改造及工业化应用提供了一定的理论依据和数据支持⊙

本发明发现Phanerochaete chrysosporium来源的锰过氧化物酶具有降解黄曲霉毒素 B1的作用，并且以乳酸克鲁维酵母为宿主，构建了表达Phanerochaetechrysosporium来源的锰过氧化物酶的食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，应用该重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP发酵得到的发酵上清液在pH 4.5、40℃条件下降解黄曲霉毒素B140 h，对黄曲霉毒素B1的降解率达75.7％；

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉、寄生曲霉等多种真菌产生的有毒次级代谢产物，黄曲霉毒素B1(AFB1)是已知黄曲霉毒素家族中毒性最大的，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，对人和家畜的健康产生极大的威胁。因此在食品、饲料等行业中，黄曲霉毒素 B1的脱毒和降解显得尤为重要。

传统的黄曲霉毒素的脱毒方式有物理和化学方法。物理方法主要包括高温法、辐射法和物理吸附法。其中，采用高温法要加热至300℃才能使黄曲霉毒素B1有明显的分解，成本太高；辐射法存在辐照技术本身的放射性污染问题，辐射机理的认知不全，辐照对食物、饲料的安全性问题使辐射除毒技术的应用受到限制。化学法主要包括碱处理法和氧化法，但化学法本身存在不稳定性，在碱性条件下，黄曲霉毒素B1的内酯环被打开，变成了香豆素钠盐或铵盐，黄曲霉毒素毒性消失，但从碱性恢复到中性时，打开的内酯环会重新连接成毒素。其次，化学法安全性有待于评估，对产品的其他成分也有一定程度的破坏。黄曲霉毒素B1的生物脱毒主要是利用微生物或其产生的酶及其制剂通过生物催化的方法脱毒，与物理、化学方法相比，生物脱毒条件相对温和且高效，产品的品质得以保证，甚至有些益生菌还能提升产品的营养价值。

已知锰过氧化物酶家族具有降解芳香族化合物的特殊能力，因此其在纸浆的生物漂白、褐煤的生物降解、农业废弃物的处理、有机污染物的降解等工业和农业应用方面有重要作用。例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)来源的锰过氧化物酶，在之前的研究报道中主要应用于降解木质素领域，但从未发现其具有降解黄曲霉毒素的作用。另外，目前有在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)以及大肠杆菌(Escherichia coli)中成功异源表达不同来源的锰过氧化物酶的报道，但是巴斯德毕赤酵母表达系统易分泌产生有害代谢产物，且需要利用有害化学物质甲醇进行诱导表达，并不适合应用于食品、谷物加工、农业等领域；而大肠杆菌本身就是致病菌的一种，当使用大肠杆菌作为表达宿主时，还会导致锰过氧化物酶蛋白不能够正确折叠，从而以没有活性的包涵体形式存在，需要繁琐的重折叠过程使酶恢复活性，实验操作繁杂且成本高，也不适合应用于食品、谷物加工、农业等领域。

发明人：夏雨 孙莹 吴梓凤 吴世嘉 刘祖河 刘琦 王周平

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明构建了食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，该菌株能够将锰过氧化物酶直接分泌到发酵上清液中，发酵上清液可用于降解黄曲霉毒素B1，表达产物直接分泌到发酵上清液中，和现有技术中以大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母作为表达宿主表达锰过氧化物酶相比，具有不需要经过重折叠等过程、步骤简单、成本低、无需使用有害诱导物、安全性高等优点，适宜在食品工业大规模应用。

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