本发明公开了一种提高L 异亮氨酸合成纯度的乙酰羟酸合酶突变体,属酶代谢工程领域。本发明通过将SEQ ID NO.1所示的乙酰羟酸合酶第47位氨基酸进行定点突变,改变了蛋白质分子与底物的结合效率,提高了L 异亮氨酸的合成量,降低了L 缬氨酸的合成量。本发明改造的谷氨酸棒状杆菌工程菌将L 异亮氨酸合成能力提高12.4%的同时,将L 缬氨酸的合成能力降低了62.0%,显著增加了L 异亮氨酸的纯度和产量,为其在食品、医药、化妆品和饲料中的应用提供了重要的价值。

针对现有技术中L-异亮氨酸合成量低、副产物L-缬氨酸合成量高的问题，本发明通过对乙酰羟酸合酶进行点突变，提供了一种提高L-异亮氨酸合成，降低副产物L-缬氨酸合成的乙酰羟酸合酶的突变体。

本发明的第一个目的是提供一种提高L-异亮氨酸合成，降低L-缬氨酸合成的乙酰羟酸合酶的突变体，所述乙酰羟酸合酶的突变体是将SEQ ID NO.1所示的乙酰羟酸合酶第47位的异亮氨酸突变为酪氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述乙酰羟酸合酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述乙酰羟酸合酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明的第二个目的是提供一种提高L-异亮氨酸合成，降低L-缬氨酸合成的谷氨酸棒状杆菌工程菌；所述工程菌是以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)WM001为宿主，将乙酰羟酸合酶突变体的重组表达质粒转化到宿主中。

L-异亮氨酸是人体必需氨基酸，广泛应用于食品、医药、化妆品和饲料等行业。微生物发酵法是目前合成L-异亮氨酸的主要方法，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是微生物发酵法合成L-异亮氨酸的重要菌株。

乙酰羟酸合酶(Acetohydroxyacid synthase,AHAS)是支链氨基酸(L-缬氨酸、L-亮氨酸、和L-异亮氨酸)生物合成途径中关键的酶，它既可以催化两分子的丙酮酸缩合形成2-乙酰乳酸，又可以催化一分子的丙酮酸和一分子的2-酮丁酸缩合形成2-乙酰-2-羟基丁酸。2-乙酰乳酸是L-缬氨酸和L-亮氨酸合成过程中的重要前体，而2-乙酰-2-羟基丁酸是L-异亮氨酸合成过程中的重要前体。在发酵生产L-异亮氨酸的过程中，L-缬氨酸作为副产物大量存在，对于L-异亮氨酸的分离、纯化造成了困难。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明还要求保护所述乙酰羟酸合酶突变体及其基因在提高L-异亮氨酸合成、降低L-缬氨酸合成中的应用。

本发明还要求保护所述乙酰羟酸合酶突变体及其基因在制备含L-异亮氨酸或其衍生物的食品、医药、化妆品和饲料中的应用。

本发明的有益效果：本发明对来源于谷氨酸棒状杆菌的乙酰羟酸合酶进行定点突变，将乙酰羟酸合酶特异性合成L-异亮氨酸的能力提高了12.4％，同时将其合成L-缬氨酸的能力降低了62.0％，为L-异亮氨酸的大量、高纯度合成及其在在食品、医药、化妆品和饲料中的应用提供了重要的理论基础。

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