本发明公开了一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用,属于酶工程技术领域。本发明的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第212位谷氨酸替换为组氨酸和/或第222位精氨酸替换为赖氨酸。本发明通过分子对接模拟确定褐藻胶裂解酶活性中心氨基酸并进行定点饱和突变改变蛋白质分子活性位点附近氨基酸残基,提高褐藻胶裂解酶催化效率,进一步提高褐藻胶裂解酶产量。本发明构建的褐藻胶裂解酶分泌能力增强的重组大肠杆菌可将褐藻胶裂解酶酶活较出发菌株提高2.83倍。改造后的基因工程菌产酶能力显著提高,摇瓶发酵生产褐藻胶裂解酶酶活达到15000U/mL,更适合工业应用,可降低生产成本,提高生产效率。

本发明通过PCR定点饱和突变得到催化活性和底物偏好性明显提高的突变体，为其进一步的工业化应用奠定基础。

本发明的第一个目的是提供一种褐藻胶裂解酶突变体，所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第212位谷氨酸替换为组氨酸和/或第222位精氨酸替换为赖氨酸。

进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第212位谷氨酸替换为组氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，将将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第222位精氨酸替换为赖氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第212位谷氨酸替换为组氨酸，并将第222位精氨酸替换为赖氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

褐藻是三大藻类之一，主要成分为褐藻胶、甘露醇和海带多糖。其中，甘露醇和海带多糖的利用的相关研究较为成熟，因此，如何高效降解褐藻胶并实现工业化应用是目前研究的热点。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)构成的线性多糖，其降解产物褐藻寡糖具有重要的生理活性，如抗氧化、抗肿瘤、促进植物根细胞生长等，因此受到了广泛的关注。

褐藻胶裂解酶(Aly)可以通过β-消除反应机制来降解褐藻胶，并且在降解产物的非还原端形成不饱和的碳碳双键，由此于紫外235nm下产生特殊吸收峰，可用来进行产物检测。根据Aly的底物特异性，可将其分为polyM，polyG和双功能型的褐藻胶裂解酶；根据其酶切方式，可将其分为内切型(endo-type)和外切型(exo-type)褐藻胶裂解酶，内切型Aly降解褐藻胶的终产物为褐藻寡糖(AOs)，常见产物聚合度为2-6，而外切型Aly的产物单一，终产物为单糖，但也有二糖为最小酶切单元的报道；根据CAZY数据库的分类，褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶(PL)，并具体分为PL-5，PL-6，PL-7，PL-14，PL-15，PL-17和PL-18七个家族。

目前，制备褐藻寡糖的方法主要是酸解等化学法，制备条件剧烈且容易造成环境污染，而相比之下，生物法降解褐藻多糖条件温和、易于控制并且绿色环保，因此开发高效、稳定性高且易于制备的褐藻胶裂解酶是十分必要的。目前的研究表明，基因工程是提高褐藻胶裂解酶酶活的主要手段。另外，常规的提高重组蛋白表达水平的方法是更换强启动子，高分泌能力强的信号肽等。

根据褐藻胶裂解酶的性质不同具有不同的划分方式：根据褐降解底物专一性的不同褐藻胶裂解酶可分为三类：专一性酶解甘露糖醛酸片段(PolyM)的酶，专一降解古罗糖醛酸片段(Poly G)的酶以及两种片段都可裂解的双功能裂解酶。但是现有的褐藻胶裂解酶的性能还需要进一步提高以适应工业化应用的需求。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明通过分子对接模拟确定褐藻胶裂解酶活性中心氨基酸并进行定点饱和突变改变蛋白质分子活性位点附近氨基酸残基，提高褐藻胶裂解酶催化效率，进一步提高褐藻胶裂解酶产量。本发明构建的褐藻胶裂解酶分泌能力增强的重组大肠杆菌可将褐藻胶裂解酶酶活较出发菌株提高2.83倍。改造后的基因工程菌产酶能力显著提高，摇瓶发酵生产褐藻胶裂解酶酶活达到15000U/mL，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。