本发明公开了热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻水解酶突变体及其应用,属于基因工程和酶工程技术领域。本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖水解酶的两个氨基酸位点分别进行突变,得到了与亲本麦芽寡糖基海藻糖水解酶相比更高的热稳定性。本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶两个突变体在60℃的半衰期半衰期比野生型增加5和8min,分别为是野生型的1.3和1.5倍,同时海藻糖转化率都比野生性提高。

本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高麦芽寡糖基海藻糖水解酶的热稳定性，为其工业化生产创造条件。

本发明提供了一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第137氨基酸进行突变得到的；

或所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第216位氨基酸进行突变得到的。这些突变体与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖水解酶相比，热稳定性提高。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第137位氨基酸由亮氨酸突变为甲硫安酸得到的；

或所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第216位氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸得到的。

海藻糖(Trehalose)是一种自然界中广泛存在的二糖，由两个葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，因为其独特的高保湿性，热酸稳定性和安全性，被广泛应用于食品，农业，医药，化妆品。从20世纪80年代开始，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。

目前，生产海藻糖的方法主要有三种，分别是酸化酶法、海藻糖合酶单酶法、MTSase和MTHase双酶法。其中，MTSase和MTHase双酶法采用液化后的淀粉作为底物，两个酶协同反应，生产海藻糖，该方法生产海藻糖的转化率较高，副产物较少，并用廉价的淀粉作为底物，降低了成本，因而得到了广泛的应用。

在应用MTSase和MTHase双酶法制备海藻糖的过程中，淀粉经过高温液化后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精；麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α,α-1,4-糖苷，产生α,α-1,1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖；麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。

因此，麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)是双酶法生产海藻糖的关键酶之一。

麦芽寡糖基海藻糖水解酶有两种类型，高温酶和中温酶，其中，高温酶在宿主中表达差，比活相对中温酶低，但中温酶因为稳定性较差，转化温度不能过高，导致反应中容易染菌，同时，还要在后续补加酶，成本较高，因而，对于中温酶的热稳定改造显得尤为重要。

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(1)本发明构建了一个有意义的麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体，实现了麦芽寡糖基海藻糖水解酶热稳定性的提高；

(2)本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体L137M和A216T在60℃的半衰期分别比野生型增加5和8min，分别为是野生型的1.3和1.5倍，说明本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体的稳定性较野生型分别提高了1.3和1.5倍；

(3)利用本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体生产海藻糖，在相同的加酶量6.0U/mL的条件下，野生型和L137M和A216T三者转化率分别是51.3，52.6和55.7％，说明本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体L137M和A216T在稳定性改善的同时，提高了海藻糖的转化率。

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