本发明公开了一种γ PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用,是一种从糖质原料一步法发酵合成γ–聚谷氨酸的生产工艺,属于合成生物学和发酵工程领域。本发明将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ 聚谷氨酸合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达,在此基础上,利用不同强度的RBS调控元件调控合成酶基因簇各基因的表达水平获得的重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所生产的γ PGA分子量为295.47~28018kDa。本发明成功地构建了聚谷氨酸的外源合成途径,实现理性控制γ PGA分子量的目的,节省了原料和过程控制成本,提高了经济效益,拓展了聚谷氨酸的应用范围,具有很好的工业应用价值和前景。

本发明的第一个目的是γ-聚谷氨酸合成酶基因capBCA表达水平单独调控并串联，先提取地衣芽孢杆菌基因组，通过PCR分别扩增出γ-聚谷氨酸合成酶基因capB、capC、capA，选取2种强度的基因调控元件，分别单独调控聚合酶基因capB、capC、capA，再通过同尾酶技术得到串联表达重组质粒，转化到感受态细胞***中，最终构建了单独调控聚合酶基因重组菌株。

进一步的，所述γ-聚谷氨酸合成酶基因，在本发明的一种实施方式中，来自于地衣芽孢杆菌，从ATCC购买，菌株号为ATCC 9945a。

进一步的，所述的基因调控元件，在本发明的一种实施方式中，是双顺反子结构标准化的RBS，即BCD-RBS。

进一步的，所述的2种强度，在本发明的一种实施方式中，是低强度BCD-RBS1和高强度BCD-RBS10。

进一步的，所述同尾酶连接技术，在本发明的一种实施方式中，是一种直接用于路径的新型模块化合成生物学工具ePathBrick。

进一步的，所述的串联表达重组质粒，在本发明的一种实施方式中，是pZMI(Ptac)-BCD-R1/R10-capBcapCA、pZMI(Ptac)-capB-BCD-R1/R10-capC-capA、pZMI(Ptac)-capBC-BCD-R1/R10-capA。

本发明的另一个目的是提供一种单独调控聚合酶基因重组菌株，在本发明的一种实施方式中，是Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A。

本发明的另一个目的是提供一种利用表达所述基因工程菌发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。

进一步的，所述方法，在本发明的一种实施方式中，是将Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A从保菌冻存管中吸取2-5μL菌液，在LB-Glu(含卡那霉素25mg/L)平板中划线，培养24h(30℃)。挑单菌落到种子培养基中，32℃，120rpm往复培养12h，按5％的接种量接入发酵培养基中，32℃、120rpm培养2h，加入IPTG诱导1h后温度调为37℃培养96h。

本发明的另一个目的是提供所述方法得到的聚谷氨酸。

进一步的，所述聚谷氨酸，在本发明的一种实施方式中，分子量为295.47～28018kDa。

本发明的另一个目的是提供本发明得到的聚谷氨酸在食品、化妆品、生物医学、环境保护领域的应用。

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体聚合成的生物聚合物，具有水溶性高、良好的生物降解特性、较强的增稠能力等性质，对重金属离子具有优异的吸收性和结合能力。近年来，γ-PGA广泛应用于食品、化妆品、生物医学、环境保护等领域。聚谷氨酸分子量是限制其应用的一个重要因素，例如用于水处理领域的聚谷氨酸分子量需要在150-200kDa左右，而化妆品领域需要80-120kDa左右的聚谷氨酸，医药载体领域则需要低分子量聚谷氨酸，例如，分子量30-60kDa的聚谷氨酸可以用于合成水溶性γ-PGA-紫杉醇偶联物抗肿瘤，11kDa大小的γ-PGA可以促进钙吸收。目前，主要有物理、化学、酶法降解等方法控制其分子量。物理法操作过程简单，但效率较低，产品稳定性较差，化学法引入化学试剂，造成污染，反应条件复杂，产生大量工业废水，而酶解法利用γ-PGA降解酶酶解，步骤繁琐，也不是控制γ-PGA分子量大小的高效方法。

为解决上述问题，相关研究以***为底盘微生物，异源表达不同来源的γ-PGA合成酶基因，通过微生物发酵法直接合成得到了一定分子量范围的聚谷氨酸。但是其仍然不能达到精确控制γ-PGA分子量，以满足不同应用需求。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

(1)构建的重组菌株能够合成不同产量的γ-PGA，为进一步提高γ-PGA产量提供有效方法；(2)通过单独调控聚谷氨酸合成酶基因，可以合成不同分子量大小的γ-PGA，分子量为295.47～28018kDa。本研究通过高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌为底盘微生物，外源表达来源于地衣芽孢杆菌中γ-聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA，并且通过双顺反子标准化后的核糖体结合位点RBS分别单独调控聚合酶基因capBCA，实现γ-PGA的分子量的精准调控。因此，本发明所提供的方案，对于利用谷氨酸棒杆菌高产不同分子量的γ-聚谷氨酸的研究具有普遍的意义。

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