本发明公开了一种优化启动子提高γ 谷氨酰胺转肽酶表达量的方法,属于基因工程领域。本发明实现了***来源的γ 谷氨酰转肽酶基因在枯草芽孢杆菌168中的高效表达,采用本发明所提供的优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的启动子,构建的基因工程菌对γ 谷氨酰转肽酶的表达量,较采用未优化的启动子构建的基因工程菌对γ 谷氨酰转肽酶的表达量,分别提高了30%、63%。

发明提供了一种启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体携带上述启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括目的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因在启动子的下游。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因为编码γ-谷氨酰转肽酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pMA5质粒。

本发明还提供了含有上述启动子或上述表达载体的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为枯草芽孢杆菌168。

本发明还提供可一种提高基因表达量的方法，所述方法是利用核苷酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的启动子诱导基因的表达。

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT，EC***)负责催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰分子转移到其他氨基酸、短肽等受体分子上(转肽反应)或水分子上(水解反应)，广泛存在于哺乳动物和细菌中。γ-谷氨酰转肽酶可以用于临床诊断、催化合成氨基酸衍生物方面、催化合成药物或药物前体、催化合成茶氨酸、谷胱甘肽等，还可以用于改善某些苦味氨基酸的风味。这对于医学、化工行业以及食品的发展意义重大。同时，γ-谷氨酰转肽酶在工业上也用来生产L-茶氨酸，因此γ-谷氨酰转肽酶酶活的提高对于工业生产也具有很大的意义。

目前γ-谷氨酰转肽酶的表达多选用大肠杆菌体系，江南大学吴敬教授课题组利用大肠杆菌的分泌型质粒实现了γ-谷氨酰转肽酶蛋白的胞外分泌，但是该大肠杆菌宿主表达体系仍存在一定的安全隐患。发明人课题组前期成功在***中实现了该蛋白的过量表达，胞外获得可观的蛋白酶含量。上述研究为我们实验提出了要求和思路：生产菌株的绝对安全性和目的蛋白能否在宿主菌中实现胞外分泌。钝齿棒杆菌SDNN403(保藏编号CGMCC0890)是经过多级诱变筛选获得，适用于多种氨基酸高产的安全菌株，具备高效表达外源蛋白的潜力。发明人课题组前期利用PXMJ19质粒，实现了***来源的γ-谷氨酰转肽酶基因在***的表达。同时发现γ-谷氨酰转肽酶蛋白的信号肽片段可以在钝齿棒杆菌中被识别，从而引导该目的蛋白分泌到胞外，胞外γ-谷氨酰转肽酶活力仅为10.31U/mL，并申请了相关专利(申请号201610454875.8)，而一种提高γ-谷氨酰转肽酶表达量的方法(申请号：201610576989.X)中提到以钝齿棒状菌为宿主，并在γ-谷氨酰转肽酶基因后加poly(A/T)尾巴，酶活也仅仅才有20.62U/mL；但是，相比于工业化生产要求，该酶的表达量偏低，会增加上游生产成本。

枯草芽孢杆菌不产生致热致敏性蛋白质，是大家公认的食品安全级微生物，其遗传学特性清楚，发明人课题组尝试以枯草芽孢杆菌作为宿主，构建可以表达γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌，但是其表达量低，限制了其工业化应用及其发展；因此，迫切需要找到一种可提高γ-谷氨酰转肽酶在枯草芽孢杆菌基因工程菌的表达量的方法。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

(1)本实验实现了***来源的γ-谷氨酰转肽酶基因在枯草芽孢杆菌168中的高效表达。

(2)采用本发明所提供的优化后的启动子构建的基因工程菌对γ-谷氨酰转肽酶的表达量，较采用未优化的启动子构建的基因工程菌对γ-谷氨酰转肽酶的表达量分别提高了30％、63％。

(3)本发明所采用的宿主细胞为枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌由于不产生致热致敏性蛋白质，是大家公认的食品安全级微生物，并且其遗传学特性清楚，有很多噬菌体和质粒可用作克隆载体；也没有明显的密码子偏好性，而且表达过程不易形成包涵体；此外其表达系统本身具有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣，分泌能力强；其生长速度很快，发酵工艺成熟。因此，本发明所构建的表达系统不但可以满足工业生产的安全性，而且可以满足工业生产的强度。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。