本发明公布了一种生产香叶基香叶醇的酿酒酵母工程菌的构建和应用,属于合成生物学技术领域。本发明筛选获得了在酿酒酵母中转化效率较高的香叶基香叶基焦磷酸合成酶PaGGPPs。表达tHMG1、PaGGPPs ERG20和PaGGPPs DPP1可促进香叶基香叶醇的积累。表达CHK1和IPK1,同时缺损ROX1基因可进一步促进香叶基香叶醇的积累。本发明构建的基因工程菌摇瓶发酵最高能够积累0.77g/L香叶基香叶醇,5L发酵罐120h能够积累4.3g/L香叶基香叶醇。

本发明提供了一株生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。本发明制备得到酿酒酵母工程菌生产香叶基香叶醇具有较高产率。本发明的技术方案如下：

一种酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌染色体整合表达强化甲羟戊酸途径基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因，同时缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因；

所述甲羟戊酸途径基因为tHMG1；

所述甲羟戊酸途径基因为双拷贝；

所述香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因为PaGGPPs-ERG20和PaGGPPs-DPP1；

所述两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因为CHK1和IPK1；

所述整合表达均使用GAL启动子；

所述缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因为缺损ROX1基因。

所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主。

所述酿酒酵母工程菌以pMD-19T simple为整合表达载体。

所述PaGGPPs-ERG20的核苷酸序列如SEQ NO:1所示；PaGGPPs-DPP1的核苷酸序列为SEQ NO:2。

所述tHMG1的核苷酸序列为SEQ NO:3。

所述IPK1的核苷酸序列如SEQ NO:4所示；所述CHK1的核苷酸序列为SEQNO:5；所述ROX1基因核苷酸序列为SEQ NO:6。

香叶基香叶醇(geranylgeraniol)，香精油香气成分之一，被用作香水生产的佐料，同时被用作生产疏水性维生素和药剂的原材料。微生物因其生长迅速、合成特异性强、底物成本低等优点成为香叶基香叶醇合成研究重点。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是最简单的真核模式微生物，成熟快速的基因操作技术和内源性甲羟戊酸途径的存在使酿酒酵母成为了萜类化合物合成研究的热点。为了提高香叶基香叶醇前体香叶基香叶基焦磷酸的供给，有报道香叶基香叶基焦磷酸合酶的效率是二萜化合物合成的一个限速步骤，过表达BTS1-ERG20和BTS1-DPP1可以促进香叶基香叶醇的积累。同时，也有报道过表达HMG-CoA还原酶活性区域编码基因(tHMG1)可以提高异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)的供给。到目前为止，没有报道同时表达外源香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因对酿酒酵母香叶基香叶醇合成的影响。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明比较了不同香叶基香叶基焦磷酸合酶对香叶基香叶醇合成的影响，同时引入异戊烯基焦磷酸两步合成途径和缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因ROX1，构建了一种香叶基香叶醇高效合成菌株，具有工业化应用前景。过表达甲羟戊酸代谢途径限速步骤编码基因tHMG1，是为了增强甲羟戊酸途径的代谢流，提供充足的前体IPP和DMAPP合成FPP和GGPP；引入两步法合成途径，是为了增加前体IPP合成FPP和DMAPP；缺损转录抑制因子编码基因ROX1，是为了提高甲羟戊酸途径基因的转录水平，进一步增强甲羟戊酸合成IPP和DMAPP的能力；表达外源香叶基香叶基焦磷酸合成酶，是为了促进FPP转化成GGPP，提高香叶基香叶醇的产量，同时弱化甾醇途径(竞争途径)消耗FPP。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。