一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法,属于酶工程技术领域。本发明将相同酶活的葡聚糖酶AnEglA6和BglA等体积混合,得到复配型酶液;取10×处理液BG01加入复配型酶液中混合,58 62℃保温25 35min,冰水浴冷却;加入第二种10×处理液BG02,在58 62℃保温25 35min,冰水浴冷却;继续加入10×处理液BG03,充分混合,即得高稳定性葡聚糖酶。采用本发明方法获得的葡聚糖酶SL04在pH4~6.5范围内活性稳定在60%以上,在4℃环境存储7天酶活下降幅度在40%以内。本发明获得的高稳定性葡聚糖酶在酒精发酵等领域有应用前景。

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法，针对上述葡聚糖酶混合液进行处理，所得的葡聚糖酶混合液的稳定性明显提高。

本发明的技术方案，一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法，将相同酶活的葡聚糖酶AnEglA6和BglA等体积混合，得到复配型酶液；取10×处理液BG01加入复配型酶液中混合，58-62℃保温25-35min，冰水浴冷却；加入第二种10×处理液BG02，在58-62℃保温25-35min，冰水浴冷却；继续加入10×处理液BG03，充分混合，即得到高稳定性葡聚糖酶SL04。

所述10×处理液BG01，具体为：10mM柠檬酸-柠檬酸钠，10mM KCl，1mmol/L MnSO4，2mmol/L CuSO4，5g/L 凝结多糖，2U菠萝蛋白酶的水溶液，pH为4.1-4.3。

所述10×处理液BG02，具体为：30mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钾，***，0.05% SDS，20%酒精，pH为8.0±0.1。

所述10×处理液BG03，具体为：含有50mM柠檬酸-柠檬酸钠，30%酒精，pH为5.5±0.1。

所述葡聚糖酶AnEglA6和BglA。

葡聚糖酶主要用于降解生物质原料中的葡聚糖大分子。葡聚糖是一种广泛存在于植物种子中的大分子物质，具有很高的粘度。以淀粉质原料进行的发酵工业中，由于原料中含有一定量的葡聚糖，因此发酵液中添加葡聚糖酶可以有效降低发酵液的粘度，提高搅拌效率，减少搅拌能耗。在酒精发酵工业中，很多酶制剂，如糖化酶、葡聚糖酶等，在使用时一般是直接添加在发酵液中，在发酵过程中逐步水解发酵液中的大分子。微生物的发酵过程很复杂，往往伴随pH的变化，同时酒精发酵倾向于根据市场和工厂所处环境的具体情况选用尽可能廉价的原料，由此配制的发酵液的pH等特性往往有很大的变化，因此具有宽泛pH适应范围的酶制剂在应用上可以获得更稳定的效果。

本发明在前期工作中获得了两种葡聚糖酶，AnEglA6和BglA，前者是一种适应低pH环境的葡聚糖酶，其最适pH在4左右[韩冰, 王施兰, 德青美朵, 沈微, 陈献忠, 樊游. 一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析. 食品与发酵工业,2018, 44(11): 55-62.]，而后者的最适pH在6.5左右[陈玉娟, 沈微, 陈献忠, 王正祥.解淀粉芽孢杆菌 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达. 生物技术, 2011, 21(2): 22-26]。本发明将两种葡聚糖酶混合获得一种新的复配型葡聚糖酶，其酶活在pH4~6.5的范围内基本稳定。葡聚糖酶AnEglA6和BglA本身在4℃条件下基本稳定，但这两种酶混合后获得的新型复配型葡聚糖酶却很不稳定，两种酶在混合后大约1小时内酶活基本稳定，随后开始迅速下降，大约4℃下，12小时后剩余酶活不到混合时的20%，因此，这种复配酶难以存储，显然不具有应用的可能性。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明的有益效果：采用本发明方法获得的葡聚糖酶SL04在pH4~6.5范围内活性稳定在60%以上，在4℃环境存储7天酶活下降幅度在40%以内。本发明获得的高稳定性葡聚糖酶在酒精发酵等领域有应用前景。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。