本发明公开了一种利用微生物合成2 O α D 甘油葡糖苷的方法,属于基因工程技术领域。本发明所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明所述突变体是在肠膜明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶的基础上,进行定点突变实现蔗糖磷酸化酶酶活的提高的,将突变体酶在大肠杆菌中表达,并用作全细胞催化剂生产2 O α D 甘油葡糖苷,在5L发酵罐水平,可短时间内生产大量的2 O α D 甘油葡糖苷,这有利于扩大蔗糖磷酸化酶生产2 O α D 甘油葡糖苷工业化应用前景,实现大规模工业化应用。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述重组菌表达SEQ ID NO.1所示的突变体或SEQ ID NO.3所示的蔗糖磷酸化酶基因。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第138位赖氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因；

(2)将步骤(1)获得的所述基因连到表达载体pET-28a上，得到重组表达载体pET-28a-gtfAK138C；

(3)将步骤(2)获得的重组表达载体转化到宿主菌中，得到基因工程菌。

在一种实施方式中，采用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行突变。

本发明的第六个目的是提供所述蔗糖磷酸化酶突变体在产2-O-α-D-甘油葡糖苷方面的应用。

根据EC分类标准，蔗糖磷酸化酶(***，Sucrose Phosphorylase，Spase)被归类为糖苷转移酶，该酶大约有500个氨基酸残基组成，以功能性单体或二聚体的形式存在。蔗糖磷酸化酶的催化活性不依赖于其他辅因子，它能够可逆地催化蔗糖和磷酸生成D-果糖和1-磷酸-葡萄糖，除了能水解蔗糖以外，还具有催化转移葡萄糖基的能力。

应用该催化特性，蔗糖磷酸化酶能以甘油为受体，催化蔗糖合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，极具工业化价值。2-O-α-D-甘油葡糖苷在化妆品、食品、医药、保健品等领域发挥着重要作用，具有广阔的应用和市场前景；但由于缺乏经济、高效的2-O-α-D-甘油葡糖苷生产工艺，造成市场上2-O-α-D-甘油葡糖苷的需求量大，且价格昂贵。相较于2-O-α-D-甘油葡糖苷的化学合成和微生物合成方法，利用蔗糖磷酸化酶将廉价的底物蔗糖和甘油，催化合成果糖和2-O-α-D-甘油葡糖苷，是一种理想的工业化生产2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法。

在蔗糖磷酸化酶催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷中，虽然具有底物原料低廉，产物简单的优点，但也存在转化时间长、体外条件下酶的稳定性差、容易失活等问题，在一定程度上限制了蔗糖磷酸化酶的工业化应用。随着蛋白质工程、定点突变等技术手段的发展，为蔗糖磷酸化酶分子的理性改造提供了可能，对于改良酶的工业属性，推动2-O-α-D-甘油葡糖苷工业化进程具有重要意义。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明所述突变体酶是在肠膜明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶的基础上，进行定点突变实现蔗糖磷酸化酶酶活的提高的，酶活的提高有利于扩大蔗糖磷酸化酶生产2-O-α-D-甘油葡糖苷工业化应用前景，实现大规模工业化应用。试验结果表明，本发明在天然蔗糖磷酸化酶的基础上，通过定点突变生物技术改造蔗糖磷酸化酶分子结构，获得的突变体酶的纯酶液比酶活较突变前提高58％，并且利用突变体酶重组大肠杆菌全细胞转化24h底物转化率达到最大为94％，同时生成2-O-α-D-甘油葡糖苷290g/L，其中转化4h时的单位OD600转化速率为4.6mmol/(L·h·OD600)；且本发明表明138位氨基酸残基对肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。