本发明公开了一种微生物绝对定量方法及其应用,属于生物领域、发酵领域、检测领域。本发明为避免使用高额设备,如PCR仪,通过信号探针和淬灭探针组合的方式实现微生物定量。本发明的方法用于检测和微生物定量时,不需要昂贵仪器的检测流程,解决了目前的微生物定量手段均依赖较昂贵的仪器,在实际用于过程中十分受限制的问题。进一步,本发明能够实现快速微生物检测,样品不必须进行核酸提取,仅需要将样本中的微生物洗脱于缓冲液中,直接进行后续实验。基于本发明的方法、探针、检测试剂盒用于不同类型的微生物定量,具有快速、方便、便宜、准确的特点。

本发明的第一个目的是提供一种微生物定量方法，所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征微生物的生物量；其中，所述方法中不需要使用仪器使待测样品中DNA发生扩增。

在一种实施方式中，所述待测样品为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品。可选地，所述待测样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。

优选地，收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。

在一种实施方式中，所述方法为绝对定量方法，还包括：建立过氧化氢酶活性(或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标，比如催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+后溶液在波长420nm下的吸光值)与微生物的生物量的标准曲线；检测待测样品时，将检测到的过氧化氢酶活性代入标准曲线，即获得待测样品中的微生物的生物量。

传统发酵食品酿造过程中有复杂的微生物菌群参与，包括乳酸菌杆菌属，芽孢杆菌属在内的细菌，酿酒酵母等在内的真菌。这些微生物与最终产品的品质密切相关，在发酵过程中，微生物发挥各自的作用，经过一系列的降解和合成相关的生理生化反应，将原料中的淀粉，蛋白质等大分子转化为醇类，醛类，酸类，酯类等风味成分，赋予产品独特的风味和感官特征。因此，实时跟踪发酵过程中不同功能微生物的生长变化趋势对发酵过程控制，酿造工艺优化具有重要的指导意义。

目前，解析食品酿造样本中微生物的主要方法为扩增子测序技术，使用相对保守的16S rRNA基因以及ITS基因序列设计引物，通过扩增、二代测序的方法研究细菌群落和真菌群落微生物组成。但是目前该方法在生产应用中存在以下问题：第一、实时性。扩增子测序流程复杂，需要进行样本DNA提取、DNA质控、扩增、建库、测序、分析等步骤，整个过程需要数天来完成；第二、便捷性。扩增子测序流程需要繁琐的操作步骤，而且需要保证中间环节不能出现任何问题。第三、价格昂贵。扩增子测序流程中建库试剂、测序仪器均较为昂贵，在每个生产工厂实现测序平台的搭建较为困难。四、准确性。扩增子测序所得到的数据只能通过相对定量的形式表征微生物的含量，根据文献报道(Vandeputte D,Kathagen G,D’hoeH,Vieira-Silva S,Colomer M,Sabino J,Wang J,Tito R,Commer L,Darzi Y,VermeireS,Falony G,***-511.)，相对定量所观测到的微生物动态变化趋势与绝对定量结果并不相符，将会对下游的数据分析和结果判断产生误差。

也有一些方法是对传统发酵食品酿造过程中单一微生物进行定量，但是通常主要通过平板涂布技术、荧光定量PCR等方法进行定量跟踪，均存在不足之处，例如平板涂布法时效性较差、荧光定量PCR法依赖高额的仪器以及精密的实验操作环境。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明为避免使用高额设备，如PCR仪，通过信号探针和淬灭探针组合的方式实现微生物定量。本发明的方法用于检测和微生物定量时，不需要昂贵仪器的检测流程，解决了目前的微生物定量手段均依赖较昂贵的仪器，在实际用于过程中十分受限制的问题。

进一步，本发明能够实现快速微生物检测，样品不必须进行核酸提取，仅需要将样本中的微生物洗脱于缓冲液中，直接进行后续实验。同时，与荧光定量PCR定量结果相比，本发明所得到的定量结果无显著性差异。

进一步，本发明还提供一种用于五类微生物绝对定量试剂盒，利用该试剂盒采用本发明的方法进行检测，可在2.5h内完成定量工作。

综上，基于本发明的方法、探针及检测试剂盒，用于微生物定量，具有快速、便捷、便宜、准确的特点。

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