本发明公开了一种甘油诱导表达系统及在纳豆激酶生产中的应用,属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明通过将PglpD与抗终止子GlpP共同构建至枯草芽孢杆菌高拷贝质粒上,使菌体的生长和蛋白的表达分开。在发酵初期,使菌体充分利用葡萄糖等优先利用的碳源完成生长和高效积累生物量的过程;直至葡萄糖耗尽,甘油自动诱导开始之后,蛋白得到高效表达。本发明用绿色荧光蛋白和纳豆激酶验证该表达系统的调控性能,该表达系统可广泛应用于对宿主菌压力较大的蛋白和代谢产物的生产上。

本发明的第一个目的是提供一种受甘油诱导的蛋白表达系统，该系统包含了响应甘油的强启动子PglpD、启动子PglpD的终止子、启动子Pcm和抗终止子蛋白；所述启动子PglpD和启动子Pcm的转录方向相反；所述抗终止子蛋白可以与三磷酸甘油结合，且二者的结合物可与位于PglpD的终止子结合；所述强启动子PglpD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗终止子蛋白的编码基因如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述启动子Pcm的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述强启动子PglpD、启动子PglpD的终止子、启动子Pcm和抗终止子蛋白的编码基因均位于pBSG04质粒骨架上。

在一种实施方式中，所述受甘油诱导的蛋白表达系统还含有编码目的蛋白的基因；所述编码目的蛋白的基因位于PglpD的终止子的下游。

在一种实施方式中，所述目的蛋白为绿色荧光蛋白。

在一种实施方式中，编码所述绿色荧光蛋白的基因如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述目的蛋白为纳豆激酶。

本发明的第二个目的是提供含有所述受甘油诱导的蛋白表达系统的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第三个目的是提供所述受甘油诱导的蛋白表达系统在诱导表达目的蛋白中的应用。

在一种实施方式中，所述目的蛋白为纳豆激酶。

在一种实施方式中，编码所述纳豆激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第四个目的是提供一种应用甘油诱导的蛋白表达系统调控目的蛋白表达的方法，是将编码目的蛋白的基因连接至启动子PglpD的终止子的下游，并将所述蛋白表达系统转化至枯草芽孢杆菌细胞中，再将获得的重组枯草芽孢杆菌细胞在含甘油的环境下培养

由于枯草芽孢杆菌生长速度快、蛋白分泌表达能力强、发酵工艺简单，已经被广泛应用于各种酶的高效生产。另外，枯草芽孢杆菌一般被认为是安全菌株，因此也是食品和药用蛋白生产的理想宿主。枯草芽孢杆菌表达蛋白产量的关键是高效表达系统的构建及相应发酵工艺的开发，而前者最为基础。目前，得到广泛应用的枯草芽孢杆菌表达系统主要有三类：①基于P43等启动子开发的强组成型表达系统；②基于PxylA、Pgrac等启动子开发的诱导型表达系统；③基于PsrfA等启动子开发的细胞密度依赖型表达系统。

目前这些表达系统皆存在较大缺陷，亟需解决。在强组成型表达系统中，无法调节蛋白的表达时间和强度，蛋白表达与菌体生长同步进行，使得表达一些对宿主压力较大的外源蛋白时，影响菌体的正常生长，大大限制产量。在使用木糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等作为诱导剂的诱导型表达系统中，虽然蛋白表达时间和强度可调，但是昂贵的诱导剂添加会大大增加生产成本，限制期在工业规模的放大使用。而利用群体感应系统开发的细胞密度依赖型表达系统，由于摇瓶、小体系发酵罐、大体系发酵罐之间培养条件的差异，导致其放大生产稳定性较差。

葡萄糖是发酵培养常用的速效碳源，虽然细菌利用葡萄糖效率高、生长速度快，但是葡萄糖代谢常常伴随乙酸积累，大幅降低培养液的pH，对生长造成巨大压力。因此在发酵过程中往往需要大量的碱(如氨水)来调节培养液的pH。与之相对，甘油代谢中产酸较少，利用率高，被认为是发酵后期的理想碳源，复配在多种蛋白高产培养基中(如TB培养基)。随着甘油价格的逐步降低，可作为大规模发酵的主要碳源使用。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

有益效果：本发明首先利用枯草芽孢杆菌glp操纵子中的强启动子PglpD，构建甘油诱导型高效蛋白表达系统。使枯草芽孢杆菌利用培养基中的甘油生成3-磷酸甘油，使抗终止子GlpP结合3-磷酸甘油后，定位在PglpD下游，并破坏其固有的终止子，使RNA聚合酶可以继续转录，从而开启glpD基因的表达。

本发明利用构建的自诱导表达系统及相应的发酵方法，使菌体的生长和蛋白的表达分开，在发酵初期，使菌体充分利用葡萄糖等优先利用的碳源完成生长和高效积累生物量的过程；直至葡萄糖耗尽，甘油自动诱导开始之后，蛋白得到高效表达。该表达系统可广泛应用于对宿主菌压力较大的蛋白和代谢产物的生产上。

本发明使用绿色荧光蛋白sfGFP验证系统性能，发现该系统可受甘油诱导，蛋白表达强度随甘油浓度增加而加强，且表达强度高于基于P43启动子的强组成型系统。在质粒上过表达抗终止子基因glpP后，蛋白表达强度进一步提升。

本发明以纳豆激酶为例，应用该表达系统调控纳豆激酶的表达，通过在培养基中复配葡萄糖和甘油，使重组枯草芽孢杆菌在生长前期利用葡萄糖生长，并在葡萄糖耗尽，转换为利用甘油后开始诱导表达蛋白。该甘油诱导表达系统可以高效表达纳豆激酶。使用自诱导培养方法在5L发酵罐中补料发酵纳豆激酶，生物量(OD600)达到80.4，纳豆激酶酶活达到9.6U/mL。

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