一种分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用,属于食品安全免疫检测领域。本发明分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏日期:2019年11月28日,保藏编号CGMCC No.19181。利用该细胞株分泌获得异噁草酮单克隆抗体用于进行食品安全检测中异噁草酮残留的分析检测。本发明获得的异噁草酮单克隆抗体可用于免疫分析检测,其对异噁草酮有较好的检测灵敏度和特异性(IC50值为5.5 ng/mL)。本发明成果可用于制备异噁草酮的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条,为谷物、油料、蔬菜、糖料、烟草中异噁草酮残留量的检测提供有力的检测方法与手段。

（1）异噁草酮半抗原的制备：将26 μL浓硝酸溶于100 μL浓硫酸，混匀，制成混合酸溶液备用；取100 mg异噁草酮溶于325 μL浓硫酸，4℃搅拌溶解，向异噁草酮溶液中逐滴滴入混合酸溶液，-10℃反应7 h；恢复至0℃，加入2 mL冰水，逐滴加入浓氨水调节pH至4.8-5.2，有浅黄色固体析出，减压抽滤，干燥，得到产物为CLO- NO2；取50 mg CLO- NO2溶于乙醇/醋酸/水（体积比2:2:1）混合溶液中，置于圆底烧瓶中，加入20 mg锌粉和3 μL浓盐酸，60℃加热回流15 min，室温搅拌40 min，由混浊变为澄清；过滤除去锌粉，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤，干燥，减压蒸干，得到半抗原CLO-NH2，半抗原合成路线见杂交瘤细胞株ABC06的制备；

（2）异噁草酮完全抗原的制备：采用碳二亚胺法将半抗原CLO-NH2分别与载体蛋白BSA及 OVA偶联制备免疫原异噁草酮-BSA和包被原异噁草酮-OVA，通过透析分离完全抗原与未偶联的半抗原CLO-NH2；

（3）小鼠的免疫：将免疫原异噁草酮-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用异噁草酮-BSA完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；

（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株ABC06；

（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

异噁草酮（clomazone，简称CLO），又称异噁草松，国外商品名为广灭灵，是一种选择性芽前除草剂。其施用后会被植物的根、幼芽吸收，随蒸腾作用向上传导到植物的各个部位，敏感植物叶绿素的生物合成会受抑制，虽然能萌芽出土，但无色素，白化，在短期内死亡，而大豆等耐药性植物吸收后能通过代谢作用，将其转化为无杀草能力的降解产物，使自身免受其害。因此，其广泛应用于大豆田、水稻田、甘蔗田及烟草田等来防除阔叶杂草和禾本科杂草。但其属长残留性除草剂，半衰期约为24 d，在土壤中的生物活性可持续6个月以上，易对后茬小麦、向日葵等作物及多种蔬菜造成药害残留，并且有研究表明其对哺乳动物的基因具有潜在的致突变性，会增加癌症风险，因此国标中对其最低残留量做出了明确规定，要求其最低检测线为10 ng/mL。

异噁草酮含量分析方法有：高效液相色谱法(HPLC)、液质联用 (LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点。因此建立快速简便的异噁草酮检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为异噁草酮检测提供了一种新的检测途径。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明的有益效果：本发明提供的杂交瘤细胞株ABC06分泌的单克隆抗体，对异噁草酮具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为5.5 ng/mL），可实现对谷物、油料、蔬菜、糖料、烟草中异噁草酮残留量的检测，为食品中异噁草酮残留的免疫学检测提供了原料，具有实际应用价值。

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