本发明公开了一种融合型腈水合酶及其应用,属于基因工程领域和酶工程领域。本发明公开了多种稳定性提高的亚基融合型腈水合酶,属于基因工程领域。本发明将来源于Pseudomonas putida NRRL 1886的腈水合酶作为初始对象,分别通过不同种类不同长度Linker融合其β亚基和α亚基,得到多种亚基融合型腈水合酶,稳定性得到显著提高。本发明方法简单高效,不仅得到了稳定性显著提高的腈水合酶可用于工业生产,还总结了基因融合影响腈水合酶稳定性的规律,为提高腈水合酶稳定性提高理论研究①

本发明首先提供了一种融合型腈水合酶，所述融合型腈水合酶同时表达了α亚基、β亚基及调控亚基，所述融合型腈水合酶的β亚基和α亚基之间通过Linker融合；所述Linker的通式为：A(EAAAK)nA，或(GGSG)n，或(PA)n，其中，n是至少为1的整数。本发明还提供了上述融合型腈水合酶的制备方法，所述方法为：将上述重组细胞接种至LB培养基中，35～37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于25℃诱导12-18h，表达融合型腈水合酶。

腈水合酶(Nitrle hydratase，NHase)能催化腈类化合物合成相应的酰胺类产物，在丙烯酰胺和烟酰胺的工业生产上已经被广泛应用，在工业生产中，NHase主要应用于高纯度烟酰胺和丙烯酰胺的生产，丙烯酰胺的酶法生产是绿色生物催化法代替化学合成法的典型案例，具有诸多优势如：工艺简单、反应条件温和、能耗低、三废少等，因此，Nhase在工业生产中是比较重要的酶。

但是，目前NHase在工业应用过程中普遍存在热稳定性差的问题，例如，来源于Pseudomonas chlororaphils B23、Rhodococcus rhodochrousJ1、Rhodococcus sp.N-774的NHase仅在20℃以下稳定，而腈类的水合过程属于放热反应，所以在工业催化过程中，需要用冷凝水来降低反应温度从而造成能源浪费；此外，腈水合酶的不稳定性还体现在对底物(腈类有机物)和产物(酰胺类有机物)的耐受性差，容易使腈水合酶失活；例如在丙烯酰胺的酶法制备过程中，由于腈水合酶对底物和产物的耐受性不高，导致终产物丙烯酰胺只能维持较低的水平，给后续的丙烯酰胺浓缩工艺带来影响。随着市场的不断拓展，酰胺类化合物的需求也日益剧增，因此如何提高腈水合酶的热稳定性及产物耐受性已成为研究重点。

为了解决NHase热稳定性差的问题，许多课题组采取了各种各样的策略，包括催化工艺的优化、野生菌株的筛选和驯化，以及NHase的分子改造等等；发明人课题组在前期研究过程中，通过分子手段在基因水平上以共价键的方式融合两个亚基，消除了亚基解聚的可能性，虽然使得融合型腈水合酶的稳定性提高，但是融合型腈水合酶在50℃半衰期最高仅仅是26min，仍旧不能满足工业需求。

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(1)采用本发明的融合型腈水合酶，相对于野生酶，其热稳定性得到了显著的提高，其中，融合型腈水合酶A8的半衰期高达139min，是野生酶的7.7倍；融合型腈水合酶B8的半衰期高达94min，是野生酶的5.2倍；融合型腈水合酶C8的半衰期高达53min，是野生酶的近3倍。本发明提供的热稳定性提高的融合型腈水合酶，可以克服工业生产中腈水合酶热稳定性低的缺陷，提高产率，节约成本。

(2)采用本发明提供的技术方案，底物耐受性及产物耐受性均得到了显著的提高，其中，采用底物3-氰基吡啶进行反应时，融合型腈水合酶A8、B8、C8的相对酶活由采用野生酶进行反应时的较低的相对酶活(30％)提高到84％、89％、86％；采用产物尼克酰胺下处理30min后，融合型腈水合酶A8、B8、C8的相对酶活由采用野生酶进行反应时的较低的相对酶活(77％)提高到80％、94％、86％。

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