本发明提供了一种特异识别单核细胞增生李斯特氏菌的优化适配体序列及其应用,属于适配体应用生物技术领域。本发明方法以单核细胞增生李斯特氏菌为靶标,在SELEX筛选获得的原始适配体序列的基础上,利用剪裁手段获得可与靶细胞以高亲和性、高特异性结合的适配体。本发明的适配体是单核细胞增生李斯特氏菌的新型识别元件,具有灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的优势,并能应用于多种检测方法的构建。

本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种特异识别单核细胞增生李斯特氏菌的优化适配体序列及其应用。本发明方法以单核细胞增生李斯特氏菌为靶标，在SELEX筛选获得的原始适配体序列A15的基础上，利用剪裁手段获得4条可与靶细胞以高亲和性、高特异性结合的适配体，即A15-2、A15-3、A15-5和A15-8。

本发明的技术方案如下：

一种适配体，所述适配体为A15-2、A15-3、A15-5与A15-8，所述适配体对应核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示。

所述适配体在单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。

所述适配体在检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。

所述适配体的应用还可以在制备临床医学中单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂中应用。

所述适配体可被可提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基、氨基所修饰。

单核细胞增生李斯特氏菌是普遍存在于自然环境中的革兰氏阳性、嗜冷、兼性厌氧细菌。其致病性由李斯特细胞溶菌酶O、磷酸脂酶C、内化素和金属蛋白酶等毒力因子决定。与其他革兰氏阳性菌不同的是，单增李斯特氏菌表面含有大量共价结合到其胞壁质上的表面蛋白，也正是由于这些表面蛋白的存在，使得单增李斯特氏菌能够在各种环境下复制增殖，并侵染多种真核细胞。此外，该菌的另一危险性在于其可穿越宿主的三个主要免疫屏障--肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，引起轻度胃肠炎，严重的血液或中枢神经系统感染以及流产。因此，实现食品中单核细胞增生李斯特氏菌准确、快速和灵敏的检测，对于保障食品安全和保护人类健康都有极其重要的意义。

常用的检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法包括传统平板分离培养和生理生化鉴别法、ELISA法、PCR法、荧光定量PCR法、电化学传感器法等，然而传统的细菌培养和生化鉴定工作量大，操作繁琐且耗时；ELISA法虽有良好的特异性、准确性及较高的灵敏度，但制备特异性抗体的过程仍然繁琐且耗时，制备出的抗体稳定性差，且检测仪器较为昂贵；PCR方法虽然快速、准确，但易受实验操作及周围环境的影响，无法保证其重复性及特异性。

适配体是利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)对人工合成的随机核苷酸序列文库进行体外筛选后获得的、能够特异性识别结合靶标的一段短的单链核苷酸序列，具有筛选周期短、亲和性高、特异性好、靶标范围广且成本低廉等显著优点。与抗体相比合成方便、易于修饰、性能稳定且易于保存。这些特点使得适配体在药物递送、医学诊断、食品安全等领域具有无可匹敌的优势，且已被广泛用作各类生物传感器的识别元件。

然而由SELEX过程产生的全长适配体序列含有70～100个核苷酸，其两端均包含一段用于PCR扩增的固定引物区，这部分区域的核苷酸通常并不参与靶标的识别与结合，这种非必需的核苷酸同样可能出现在序列随机区中，它们可能形成各种二级结构从而降低适配体的靶结合构象稳定性，且较长的序列会带来较低的产率和较高的合成成本。因此，在实际使用中，在保留适配体亲和性能的前提下，获得适配体最短序列大有裨益。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

(1)与抗体相比，适配体具有可在体外筛选、筛选周期短、合成方便、易标记各种功能基团和报告分子、性质稳定可长期保存使用等优势；

(2)该序列是基于原始序列的二级结构，通过剪裁获得的亲和力和特异性均较强的适配体序列，能够特异性识别单核细胞增生李斯特氏菌；

(3)与筛选获得的原始单核细胞增生李斯特氏菌适配体相比，该适配体具有理想的亲和力、良好的特异性、更高的产率以及较低的合成成本，能够更灵敏地检测分离出环境和食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌。

(4)本发明的适配体是单核细胞增生李斯特氏菌的新型识别元件，具有灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的优势，并能应用于多种检测方法的构建。

(5)本发明中提供的适配体可以对单核细胞增生李斯特氏菌进行定性与定量的检测，其中定性/定量的检测方法为：对适配体进行修饰，在其两端引入荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物、亲和配基或巯基，得到功能化的适配体，之后与单核细胞增生李斯特氏菌孵育反应，然后利用功能化适配体所表现出的性能，比如荧光强度、半衰期、酶活性等等进行定性与定量检测。

(6)其次，本发明提供的适配体还可以利用其与磁性纳米颗粒结合达到定量检测与富集单核细胞增生李斯特氏菌的目的。具体为：对适配体5′端进行生物素修饰，得到生物素化适配体；之后利用生物素与亲和素的特异性结合将所述适配体结合到磁性纳米颗粒表面，得到适配体功能化磁性纳米颗粒；之后利用适配体和单核细胞增生李斯特氏菌的特异性结合，在外磁场的作用下可分离并富集样品中的单核细胞增生李斯特氏菌，实现单核细胞增生李斯特氏菌的定性或定量检测。

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