本发明涉及一株产L 异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌,属于基因工程和发酵工程技术领域。该菌株以L 异亮氨酸工业生产菌WM001为基础,通过基因敲除、过表达等手段对其L 异亮氨酸合成代谢途径进行改造,最终得到的菌株WM005/pYCW 1 ilvBN ppnK能够稳定遗传,且在制备L 异亮氨酸过程中无需添加抗生素,减少了产生耐药性菌株的风险,制备得到的L 异亮氨酸适合医疗、化妆品、工业等各个领域的生产,不会因为抗生素而造成产品的污染;在5L发酵罐补料分批发酵中积累32.1g/L的L 异亮氨酸,糖酸转化率达到0.181g/g,适用于L 异亮氨酸的工业化生产。

本发明旨在提供一株通过启动子替换、基因敲除和基于alr的营养缺陷型互补表达系统，运用多种代谢工程策略，最终构建无需添加抗生素的高产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌工程菌。

本发明提供了一株生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK，所述工程菌是以菌株WM001为出发菌株，所述菌株WM001是一株由ATCC13869随机诱变得到的L-异亮氨酸工业生产菌，构建方法记载于Wenjian M,Jianli W,Ye L,***(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)co-produced with l-isoleucinein Corynebacterium glutamicum WM001[J].Microbial Cell Factories,2018,17(1):93。

一种生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK的制备方法，所述方法是将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac，敲除基因alaT、brnQ，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK。

在本发明的一种实施方式中，先扩增出启动子tac片段和启动子ilvA的上下游片段，构建得到包含启动子tac的载体，再将所述载体转入WM001中，得到含启动子tac的菌株WM002。

在本发明的一种实施方式中，所述包含启动子tac的载体是在载体pDXW-3的基础上，将ilvA启动子替换为tac启动子的片段连接，得到载体pYCW-tacPilvA。

在本发明的一种实施方式中，所述载体pDXW-3的构建方法记载于论文《Construction of a novel sacB-based system for marker-free gene deletion inCorynebacterium glutamicum》中。

L-异亮氨酸是人体必需的三种支链氨基酸(BCAA)之一，在各种工业应用中用于生产各种产品，例如人类营养增强剂，动物饲料添加剂，医疗产品成分和化妆品成分。L-异亮氨酸主要通过微生物发酵生产，而大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌是主要的生产菌株。但是，大肠杆菌通常会合成内毒素，这可能会污染产品。因此，谷氨酸棒状杆菌成为生产L-异亮氨酸的理想菌株。

在谷氨酸棒状杆菌中，由于L-异亮氨酸与其他氨基酸相互交织合成：从L-天冬氨酸开始，由十个反应步骤组成的L-异亮氨酸生物合成途径是复杂的。因此，L-异亮氨酸的生产是比较困难的。L-异亮氨酸生物合成途径中有十种关键酶分别为天冬氨酸激酶(AK)，半醛脱氢酶(ASD)，高丝氨酸脱氢酶(HD)，高丝氨酸激酶(HK)，苏氨酸合酶(TS)，苏氨酸脱水酶(TD)，乙酰羟酸合酶(AHAS)，乙酰羟酸异构酶(AHAIR)，羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)，它们分别由基因lysC，asd，hom，thrB，thrC，ilvA，ilvBN，ilvC，ilvD和ilvE编码。从理论上讲，TD(ilvA基因编码)和AHAS(ilvBN基因编码)在这些酶中更为重要，TD催化形成L-异亮氨酸生物合成的关键前体物质——2-酮丁酸；AHAS在平衡谷氨酸棒状杆菌细胞中L-缬氨酸和L-异亮氨酸的水平方面起着重要作用，它可以催化两个丙酮酸分子的缩合，导致L-缬氨酸的合成，或者丙酮酸和2-酮丁酸的缩合，导致L-异亮氨酸合成。

近些年来，一些代谢工程策略用于改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸的研究已被报道，通过敲除基因alaT可以减少主要杂酸L-丙氨酸和增加丙酮酸前体物质供应(alaT可以将丙酮酸转换成L-丙氨酸，而L-丙氨酸是L-异亮氨酸生产的主要杂酸；减少L-丙氨酸同时增加胞内的-丙酮酸，丙酮酸也是前体物质)，通过敲除brnQ可以避免L-异亮氨酸的主动输入(brnQ基因是将L-异亮氨酸从胞外摄取到胞内的关键基因，敲除后可使胞外L-异亮氨酸含量更高)，有利于谷氨酸棒状杆菌的L-异亮氨酸生产。但是尚无报道结合多种策略于改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸。此外，通过强启动子替换过表达ilvA可以增加2-酮丁酸前体物质供应。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

(1)本发明构建的一株L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK，遗传性能稳定，且在制备L-异亮氨酸过程中无需添加抗生素，避免了工业添加的成本问题和减少了产生耐药性菌株的风险；制备得到的L-异亮氨酸适合医疗、化妆品、等各个领域的工业生产，不会因为抗生素而造成产品的污染。

(2)在L-异亮氨酸工业生产菌WM001基础上，通过启动子tac替换ilvA和敲除alaT分别增加了2-酮丁酸和丙酮酸供应，通过敲除brnQ优化L-异亮氨酸运输系统，并且通过基于alr的营养缺陷型互补表达系统过表达ilvBN和ppnK，分别强化碳流和NADPH供应。本发明通过多种代谢工程策略的结合使得工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK在5-L发酵罐补料分批发酵中积累32.1g/L的L-异亮氨酸，糖酸转化率达到0.181g/g，是目前报道中非常有竞争力的工业生产菌。

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