本发明公开了一种降解透明质酸的不动杆菌及其培养方法和应用,属于化妆品生物技术领域。本发明中不动杆菌(Acinetobacter sp.)于2019年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.18660。本发明首次利用该不动杆菌制备透明质酸酶,可用于制备低分子透明质酸的工艺。以0.2%终浓度分子量为1200kDa的透明质酸钠为底物测得该菌株胞内酶活可达到3854U/mL。该酶的最适温度和最适pH分别为37℃和pH 6.0,对透明质酸特异性高,可应用于工业化生产,从而替代价格高昂的动物组织提取到的透明质酸酶。在医药及化妆品等领域具有广阔的应用前景。

1)取不动杆菌BDGJ001菌种接种至液体种子培养基中，在温度为25～40℃、转数为150～300rpm的条件下，摇床培养18～28小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)所获得的种子液，划线于固体培养基，在温度为25～40℃条件下培养24～48h，制得单菌落；

(3)挑取步骤(2)中制得的单菌落，接种于液体发酵培养基中，在温度为25～40℃，150～300rpm的条件下扩大培养18～28小时，制得不动杆菌BDGJ001菌液。

根据本发明优选的，步骤(1)所述液体种子培养基每升组分如下：

1～10g蛋白胨、1～10g酵母粉、1～10g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、0.1～1g七水硫酸镁、1～5g磷酸三钾三水、0.1～1000mL水，pH值为6～8。

根据本发明优选的，步骤(2)所述固体培养基每升组分如下：

1～10g蛋白胨、1～10g酵母粉、1～10g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、0.1～1g七水硫酸镁、1～5g磷酸三钾三水、水1000mL，15～25g琼脂粉，pH值为6～8。

根据本发明优选的，步骤(3)所述液体发酵培养基每升组分如下：

1～10g蛋白胨、1～10g酵母粉、1～10g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、0.1～1g七水硫酸镁、1～5g磷酸三钾三水、0.1～1000mL水，pH值为6～8。

采用盐酸、氢氧化钠和磷酸中的一种或一种以上调节种子培养基、固体培养基和发酵培养基的pH。

低分子量透明质酸(分子量为10～500kDa)以其独特的良好穿透性，优异的生物学相容性和易于吸收等特点，越来越引起人们的注意。高分子量透明质酸能够抑制新血管生成，相反地低分子量透明质酸可刺激主动脉及毛细血管，内皮细胞的增生与迁移，促进新生血管的生成。近年来大量的有关透明质酸与肿瘤相关性研究发现，肿瘤发生可能与人体内的HA平衡发生显著改变相关，这种显著改变不仅包括HA含量的变化，更重要的是HA分子量大小的差异。目前越来越多证据显示，内源性低分子量HA与肿瘤恶性程度高呈正相关，但外源性低分子量HA却具有抗肿瘤活性。

目前低分子量HA制备主要是通过物理、化学和酶等降解方法将大分子透明质酸降解为低分子量HA。物理降解法包括加热、机械剪切、紫外线、超声波、γ-射线辐射和高压均质等。物理降解法具有原理清晰，在降解过程中无需加入任何试剂，后处理过程简化，所得低分子量的HA的Mr分布范围窄，热稳定性好等优点，但通常得不到超低分子量的HA且损失严重。HA的化学降解法主要包括碱水解、酸水解和氧化降解。化学降解法成本较低，易于大规模生产，但产品中可能会有化学试剂的残留，此外，化学降解尤其是氧化降解，可能会对透明质酸单体中醛酸或羟基基团产生修饰作用，因此化学法制得的低分子量HA生物活性可能会差别较大。

酶解法由于其专一性强，反应条件温和，且多糖的结构未发生变化，可通过控制不同降解时间，得到不同分子量HA的目的，是制备低分子量HA理想的方法。由于透明质酸酶和硫酸软骨素酶的来源非常有限，价格昂贵，在很大程度上限制了它们的应用。目前文献已报道的透明质酸酶微生物主要来源是链球菌，而至今为止有关不动杆菌(Acinetobactersp.)来源的透明质酸酶则从未见报道。

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本发明提供的一种降解透明质酸的不动杆菌及其培养方法和应用，与现有技术相比，具有以下优势：本发明首次利用不动杆菌BDGJ001产透明质酸酶，可用于制备低分子透明质酸的工艺。该酶的最适温度和最适pH分别为37℃和pH6.0，对透明质酸特异性高，可应用于工业化生产，从而替代价格高昂的动物组织提取到的透明质酸酶。在医药及化妆品等领域具有广阔的应用前景。

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