本发明公开了一种高催化活性神经氨酸合酶及应用,属于遗传工程领域。本发明通过筛选不同来源的N 乙酰神经氨酸合酶,并以5个不同强度启动子优化N 乙酰神经氨酸合酶在基因组上的表达水平,将最佳表达强度的NeuB整合到可以合成NeuAc前体物质ManNAc的菌株中,提高了枯草芽孢杆菌的N 乙酰神经氨酸产量使N 乙酰神经氨酸在摇瓶中产量达到7.6g/L。

本发明的第一个目的是提供脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)来源于的N-乙酰神经氨酸合酶在提高枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用是在枯草芽孢杆菌中表达来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的N-乙酰神经氨酸合酶。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶为(a)或(b)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列基础上经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有N-乙酰神经氨酸合酶活性的酶。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶通过低强度的启动子调控表达。

在一种实施方式中，所述启动子含有SEQ ID NO.3～7任一所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种基因工程菌，具有N-乙酰-D-甘露糖胺(NeuAc)的合成能力，并表达SEQ ID NO.1所示的N-乙酰神经氨酸合酶。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶整合到可以合成N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)的枯草芽孢杆菌中。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌BSGN6-comK为宿主。

在一种实施方式中，所述基因工程菌还强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶通过SEQ ID NO.3所示的启动子调控表达。

N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，由于底物转化率较低，导致神经氨酸生产成本较高。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。

目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuB关键酶合成途径，由于现有NeuB酶催化性能较弱，限制了神经氨酸的合成效率。这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

(1)本发明通过筛选不同来源NeuB酶，发现在同样的低表达水平时，来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的NeuB相比于大肠杆菌等来源有较高的催化活性，NeuAc产量能够由0.1g/L提高至7.6g/L。

(2)本发明通过以5个不同强度启动子(P1～P5)优化N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)在基因组上的表达水平，并将最佳表达强度的NeuB整合到可以合成N-乙酰神经氨酸(NeuAc)前体物质N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)的菌株中，提高了神经氨酸产量，使摇瓶水平发酵72h的神经氨酸产量由3.7g/L提高至7.6g/L。

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