本发明公开了一种RBS优化提高γ 谷氨酰胺转肽酶表达量的方法,属于基因工程领域。起始的翻译速率对于外源蛋白的表达影响很大,通过对RBS序列进行改造,优化RBS,可以进一步提高翻译速率从而很大程度上提高目的蛋白表达量,本发明对表达载体pMA5的RBS序列进行改造,提高了酶的翻译效率,从而提高了酶活,采用本发明提供的载体pMA5 RBS361和pMA5 RBS362构建的重组枯草芽孢杆菌中,使目的基因γ 谷氨酰胺转肽酶的酶活得到了提高;其表达量较原始***分别提高了1.51倍和1.62倍。

本发明提供了一种载体，所述载体是将载体pMA5上核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的原始RBS序列替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的序列得到的，命名为pMA5-RBS361；

或者所述载体是将载体pMA5上核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的原始RBS序列替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的序列得到的，命名为pMA5-RBS362。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体还包括目的基因。

本发明还提供了含有上述载体的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为枯草芽孢杆菌168。

本发明还提供了一种提高目的基因表达量的方法，所述方法是利用上述表达载体将目的基因在宿主细胞中进行重组表达。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因为编码γ-谷氨酰胺转肽酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述γ-谷氨酰胺转肽酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了上述载体，或上述微生物细胞，或上述方法在制备L-茶氨酸中的应用。

本发明还提供了一种制备L-茶氨酸的方法，所述方法为将携带编码γ-谷氨酰胺转肽酶基因上述表达载体转入宿主细胞中构建得到重组菌，利用所述重组菌转化底物L-谷氨酰胺和乙胺生产得到L-茶氨酸。

γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT，EC***)负责催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰分子转移到其他氨基酸、短肽等受体分子上(转肽反应)或水分子上(水解反应)，广泛存在于哺乳动物和细菌中。γ-谷氨酰胺转肽酶可以用于临床诊断、催化合成氨基酸衍生物方面、催化合成药物或药物前体、催化合成茶氨酸、谷胱甘肽等，还可以用于改善某些苦味氨基酸的风味。这对于医学、化工行业以及食品的发展意义重大。同时，γ-谷氨酰胺转肽酶在工业上也用来生产L-茶氨酸，因此对于γ-谷氨酰胺转肽酶酶活的提高对于工业生产也具有很大的意义。

发明人课题组前期利用PXMJ19质粒，实现了***来源的γ-谷氨酰胺转肽酶基因在***的表达。同时发现γ-谷氨酰胺转肽酶蛋白的信号肽片段可以在钝齿棒杆菌中被识别，从而引导该目的蛋白分泌到胞外，但是，胞外γ-谷氨酰胺转肽酶活力仅为10.31U/mL，并申请了相关专利(申请号201610454875.8)，而一种提高γ-谷氨酰胺转肽酶表达量的方法(申请号：201610576989.X)中提到以钝齿棒状菌为宿主，并在γ-谷氨酰胺转肽酶基因后加poly(A/T)尾巴，酶活也仅仅才有20.62U/mL；但是，相比于工业化生产要求，该酶的表达量偏低，会增加上游生产成本。

因此，目前急需得到一种提高γ-谷氨酰胺转肽酶表达量的方法，以满足工业化的生产需求以及降低生产成本。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明对表达载体pMA5的RBS序列进行改造，提高了酶的翻译效率从而提高酶活，采用本发明提供的载体pMA5-RBS361和pMA5-RBS362构建的重组枯草芽孢杆菌中，使目的基因γ-谷氨酰胺转肽酶的酶活得到了提高；其表达量较原始pMA5-***分别提高了1.51倍和1.62倍。

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