本发明公开了一种表达抗菌肽基因的乳酸乳球菌,属于基因工程技术领域。本发明通过优化CRAMP蛋白的核苷酸序列,并将构建的表达CRAMP蛋白的乳酸乳球菌用于制备调节肠道菌群紊乱的疫苗,对肠道菌群的调节以及肠道免疫应答与维持有优势,全培养物可直接作为口服疫苗刺激小鼠并引起较强的细胞免疫应答,该重组乳酸乳球菌可以作为一种具有良好产业前景的新型口服疫苗产品,对减轻肠道炎症起到积极的作用,对促进肠道健康发展具有重要的实践意义。

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中口服CRAMP易被消化道酶降低、无法实现肠道靶向递送CRAMP、最大化实现其局部免疫调节效果的缺陷，提供一种分泌表达CRAMP蛋白重组乳酸乳球菌及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种乳酸乳球菌，其表达并分泌CRAMP蛋白；所述CRAMP蛋白为(a)或(b)：

(a)如SEQ ID NO.2所示的CRAMP蛋白；

(b)在(a)的基础上对一个或几个氨基酸进行缺失、取代或增减且具有抑菌特性的由(a)衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述乳酸乳球菌以乳酸乳球菌NZ9000为宿主。

在一种实施方式中，所述乳酸乳球菌以pMG36e或pNZ8148为载体。

在一种实施方式中，所述乳酸乳球菌还引入了Usp45信号肽促进CRAMP蛋白的表达。

在一种实施方式中，所述Usp45信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供一种构建上述任一所述重组乳酸乳球菌的方法，是将SEQ ID NO.1所示的编码CRAMP蛋白的基因与载体连接，再转化至乳酸乳球菌细胞中；所述载体为pMG36e或pNZ8148。

抗菌肽是植物、无脊椎动物和脊椎动物(包括人类)等多种宿主的先天免疫和防御的主要成分。Cathelicidins是一类主要的抗菌肽，其特征在于保守的阴离子N-末端前体序列，称为cathelin。cathelin序列的保守性表明该家族的各种成员是从共同祖先基因的复制和修饰进化而来的。CRAMP(Cathelicidin-Related AntiMicrobial Peptide)含有34个氨基酸(GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ)，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有强大的抗菌活性，但对人红细胞没有溶血活性。1mM的CRAMP能够直接导致大肠杆菌内膜的立即透化。抗CRAMP的抗血清在骨髓前体和中性粒细胞中显示出丰富的表达。与天蚕素A类似，50mM CRAMP未显示出对人红细胞的任何溶血活性。此外，研究发现CRAMP对一些致病真菌(Candia alicans和Aspergillus fumigatus)和肿瘤细胞具有强大的抗生素活性。体外研究证实CRAMP能显著抑制幽螺旋杆菌的增殖；而CRAMP缺失会导致小鼠肠胃病情加重，通过表达CRAMP的乳酸杆菌治疗患有肠胃病的CRAMP敲除小鼠则显著缓解效果。

表达于肠道的CRAMP由于肠道屏障的破坏导致CRAMP水平显著下降，导致不能发挥其免疫效果，调节肠道菌群平衡，因此，选择安全无毒，能够在肠道中存活并能表达CRAMP的载体系统，使得CRAMP能够在肠道发挥作用，对调节肠道菌群平衡具有重要意义。

乳酸乳球菌因其表面分子有高黏附性的特征，能使其成功地定植于动物机体的肠道内并成为在肠道内的优势菌群而发挥提高机体免疫力、促进营养物质吸收及维持肠道内菌群平衡等多种功能。所形成的生物学稳固屏障是维持肠道微生物平衡的重要保障。在表达外源基因方面上，乳酸乳球菌表达系统作为一种原核表达系统，有以下优势：(1)作为食品级细菌，作为活载体疫苗安全性更高；(2)外源基因能被表达在细胞内，也能被表达展示在细胞表面或被分泌到细胞外；(3)安全、无内毒素，无需纯化表达的外源蛋白，直接同菌体服用；(4)能定植在机体黏膜表面(属于共同黏膜免疫系统)，接种黏膜某一位点便可诱导全身的黏膜免疫反应；最后的也是最重要的，这种免疫方式能帮机体获得的更长久免疫记忆力，以便于长期抵御病原体的侵犯。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明还要求保护所述乳酸乳球菌在制备预防或治疗炎症性肠病、腹泻或肠道稳态失衡引起的或相关的疾病的药物中的应用，所述肠道稳态失衡引起的或相关的疾病包括但不限于肝脏疾病、代谢内分泌疾病、循环系统疾病等，例如糖尿病、胰腺炎或代谢综合症。

本发明还要求保护所述乳酸乳球菌在制备预防或治疗急性结肠炎的药物中的应用。

有益效果：(1)本发明提供了一种分泌表达小鼠抗菌肽CRAMP蛋白重组乳酸乳球菌的制备方法，即采用能够调节肠道菌群且更强定植能力的乳酸乳球菌表达系统，并添加Usp45信号肽来进行CRAMP基因的分泌表达，使CRAMP蛋白的表达量可达40ng/μL；加上乳酸乳球菌作为益生菌的益生特性，使得此乳酸菌表达系统成为一个食品级表达系统，可以连同菌体一起服用。

(2)本发明将构建的表达CRAMP蛋白的乳酸乳球菌用于制备针对肠道菌群紊乱调节的疫苗，对肠道菌群的调节以及肠道免疫应答与维持上有优势，全培养物可直接作为口服疫苗刺激小鼠并引起较强的细胞免疫应答，该重组乳酸乳球菌可以作为一种具有良好产业前景的新型口服疫苗产品，对减轻肠道炎症起到积极的作用，对促进肠道健康发展具有重要的实践意义。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。