本发明公开了用于基因高效率表达的氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体,属于基因工程领域。本发明筛选了氧化葡萄糖酸杆菌内源质粒可能的复制蛋白,并利用该类内源复制蛋白构建一系列的穿梭载体,将其转入氧化葡萄糖酸杆菌内进行验证,发现其转化效率和广宿主质粒pBBR MCS相比有较大的提高;并将穿梭载体用于蛋白的表达,使氧化葡萄糖酸杆菌的L 山梨糖产量比广宿主载体的表达量提高7.8%,并使底物转化时间缩短了27.2%。本发明大大提高了对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的效率,实现对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的不同需求。

本发明的第一个目的是提供氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体，所述穿梭载体上具有如SEQ ID NO.1～15所示的基因。

在一种实施方式中，所述穿梭载体以pMD19-T Simple Vector载体为穿梭载体骨架。

本发明的第二个目的是提供含有所述穿梭载体的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是重组大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以大肠杆菌JM109为宿主，向宿主细胞中转化所述氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是重组氧化葡萄糖酸杆菌。

在一种实施方式中，所述重组氧化葡萄糖酸杆菌以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-004、氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003、氧化葡萄糖酸杆菌1.049、氧化葡萄糖酸杆菌621H或氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC 1.110为宿主。

在一种实施方式中，所述穿梭载体具有如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.25任一所示的抗生素抗性基因。

本发明的第三个目的是提供所述穿梭载体的构建方法，是将SEQ ID NO.1～15任一所示的基因连接至T载体上。

在一种实施方式中，采用Gibson组装将T载体片段与SEQ ID NO.1～15任一所示的基因连接。

本发明的第四个目的是提供所述穿梭载体在表达蛋白中的应用。

氧化葡萄糖酸杆菌是是一种严格需氧的革兰氏阴性菌，属于葡萄糖菌属，醋酸杆菌科，该类细菌主要栖息于高糖环境，如水果，花卉和蜂蜜中。葡萄糖酸杆菌具有以下几个特征使其在工业上应用广泛:(1)能快速且不完全氧化糖、醇类底物生成相应的醛、酮和酸；(2)膜结合脱氢酶催化活性位点一般位于周质空间，进行催化反应时底物不需要跨膜运输，而相应的产物则直接分泌到培养基中；(3)催化反应具有高度的区域选择性和立体选择性。氧化葡萄糖酸杆菌的特征决定了其在工业生产中的重要的应用，例如生产维生素C(vitamin C)，L-酒石酸 (L-tartaric acid)，二羟基丙酮(DHA)，米格列醇(miglitol)和5-酮基-果糖(5-ketofructose)等。

质粒是一种独立于染色体之外的可以自主复制或双链环状DNA分子，它一般含有独特的复制子结构，其决定了该质粒在细胞内的稳定性和拷贝数等性质。质粒在遗传工程领域是作为基因的克隆或者表达载体，其可以帮助外源基因转化进入宿主细胞，从而对宿主细胞进行改造。40多年前，当重组DNA技术在发展起来时，质粒载体已经成为分子生物学领域的关键工具。Cohen等人在1973年首次在体外构建了具有生物学功能的细菌质粒，此后，质粒成为在宿主细胞内传递和操纵外源DNA的载体，开创了代谢工程的新纪元，人们利用不断开发的质粒载体改造微生物代谢途径合成新产品，如2-KLG和柚皮素等。随后，随着DNA 高通量化学合成的发展，研究人员提出了系统生物学和合成生物学概念，一系列不同的质粒载体在合成生物学和代谢工程中有重要的作用，如维生素C生物合成。

目前，应用于氧化葡萄糖酸杆菌中的表达载体主要是pBBRI-MCS系列质粒或其衍生质粒，该系列质粒在属于广宿主质粒，在氧化葡萄糖酸杆菌内的稳定性及转化效率都比较差。由于氧化葡萄糖酸杆菌内可以高效转化的质粒较少以及氧化葡萄糖酸杆菌内共表达多个质粒载体缺少，这严重限制了它在工业生产中的应用潜力。本发明基于的高通量测序技术，通过对几株不同氧化葡萄糖酸杆菌基因组测序，得到氧化葡萄糖酸杆菌内野生质粒的序列，通过生物信息学分析，预测其可能的复制起始位点，并利用不同的复制起始位点构建了一系列不同性质的穿梭载体，利用这一系列不同的穿梭载体，将大大提高我们对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的效率，充分发挥其在工业生产的潜力。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明筛选了氧化葡萄糖酸杆菌内源质粒可能的复制蛋白，并利用该类内源复制蛋白构建一系列的穿梭载体，将其转入氧化葡萄糖酸杆菌内进行验证，发现其转化效率和广宿主质粒pBBR-MCS相比有较大的提高；并将穿梭载体用于蛋白的表达，其中，***15-Ptuf-sldAB1的L-山梨糖产量(148.9g/L)分别比***-Ptuf-sldAB1(138.1g·L-1)和野生菌(131.9g·L-1)提高7.8％和12.9％。而在底物转化时间上，***-Ptuf-sldAB1(16h) 分别比***-Ptuf-sldAB1(22h)和野生菌(25h)缩短了27.2％和36％。本发明大大提高了对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的效率，实现对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的不同需求。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。