本发明公开了一种γ 谷氨酰胺转肽酶突变体及其应用,属于基因工程领域;本发明在天然γ 谷氨酰胺转肽酶的基础上,通过定点突变生物技术改造γ 谷氨酰胺转肽酶分子结构,本发明所提供的突变体T401P、T422S,其转肽酶活较原始菌株分别提高了32.3%、41.8%;比酶活分别提高了近4.5倍、5.1倍,本发明表明401位点及422位点残基对于GGT催化苦味氨基酸具有重要影响,可用于改善含苦味氨基酸产品的口感与品质,这对于γ 谷氨酰胺转肽酶在医药和食品行业的应用具有重要意义。

本发明首先提供了一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第401位氨基酸突变得到的；

或者，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第422位氨基酸突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第401位氨基酸由苏氨酸突变为脯氨酸得到的，命名为突变体T401P；

或者，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第422位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸得到的，命名为突变体T422S。

本发明还提供了编码上述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pMA5质粒。

本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌168。

本发明还提供了一种生成γ-谷氨酰肽的方法，将上述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体添加至含有供体和受体的反应体系中进行反应，得到反应液，从反应液中分离得到γ-谷氨酰肽，所述供体为L-谷氨酰胺，所述受体为L-氨基酸。

γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT，EC***)负责催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰分子转移到其他氨基酸、短肽等受体分子上(转肽反应)或水分子上(水解反应)，广泛存在于哺乳动物和细菌中。γ-谷氨酰胺转肽酶可以用于临床诊断、催化合成氨基酸衍生物方面、催化合成药物或药物前体、催化合成茶氨酸、谷胱甘肽等，还可以用于改善某些苦味氨基酸的风味。这对于医学、化工行业以及食品的发展意义重大。

氨基酸通过脱水缩合组成多肽，研究表明多肽在食品中具有呈味的作用，但在起呈味的氨基酸中存在着一类苦味氨基酸，其种类主要包括：芳香族氨基酸(V、F、W)，碱性氨基酸(R、K、H)和支链氨基酸(L、V、I)。随着生活水平不断提高，人们对于食物味道的要求也越来越高，所以苦味氨基酸对于食品等行业的发展是极其不利的。

一种酶活提高的γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其构建方法(申请号：201711324140.4)中提到，通过对于γ-谷氨酰胺转肽酶的413位点的苏氨酸突变为半胱氨酸，其转肽酶活力较原始菌株仅提高12％；一种转肽活力提高的γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其构建方法(申请号：201810442796.4)中提到，通过对于γ-谷氨酰胺转肽酶第463位氨基酸由苏氨酸突变成天冬氨酸，其转肽酶活力较原始菌株仅提高22.6％，因此，目前即使有对γ-谷氨酰胺转肽酶进行改造，其改造后的酶活相较于原始菌株，提高的幅度并不大，并且对于利用以上获得的经改造后的γ-谷氨酰胺转肽酶作为催化剂生产茶氨酸的应用过程中，其转肽效率不高，进而导致副产物积累，产物产率不高等问题；还是不能够满足生产上的需求。

γ-谷氨酰胺转肽酶催化合成γ-谷氨酰肽突出的问题是，因为此酶存在水解反应，造成产物合成产率不高。一般情况下通过优化控制供体和受体之间用量比例、温度以及酶量等条件来优化反应，降低副产物的合成以提高产率，但是产物产率依然不高。如何通过对于γ-谷氨酰胺转肽酶进行理性改造，从而提高其转肽酶活力，从而进一步提高γ-谷氨酰肽的产率，这对于γ-谷氨酰肽的工业化生产以及对于食品、医药行业的发展具有重大意义。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

(1)本发明在天然γ-谷氨酰胺转肽酶的基础上，通过定点突变生物技术改造γ-谷氨酰胺转肽酶分子结构，本发明所提供的突变体T401P、T422S，其转肽酶活较原始菌株分别提高了32.3％、41.8％；比酶活分别提高了近4.5倍、5.1倍。

(2)本发明表明401位点及422位点残基对于GGT催化苦味氨基酸具有重要影响，可用于改善含苦味氨基酸产品的口感与品质，这对于γ-谷氨酰胺转肽酶在医药和食品行业的应用具有重要意义。

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