本发明公开了一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体K31A,属于蛋白质工程技术领域。本发明对从地衣芽孢杆菌基因组中克隆的CcpA基因进行突变,得到一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体K31A,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,编码其的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了包含编码上述CcpA突变体K31A基因的重组表达载体,并将构建的表达载体转化到地衣芽孢杆菌CcpA基因缺陷株中获得重组地衣芽孢杆菌。所获得的重组地衣芽孢杆菌能够明显改变由于葡萄糖存在而产生的碳分解代谢阻遏现象,能够降低地衣芽孢杆菌对木糖的偏好性①

本发明提供了一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体K31A，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了编码上述碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体K31A的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了含上述基因的重组表达载体。

本发明还提供了表达上述碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体K31A的重组微生物细胞。

进一步地，所述重组微生物细胞以地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)为宿主。

进一步地，所述地衣芽孢杆菌为CcpA基因缺陷菌株，所述CcpA基因缺陷菌株的构建方法是：地衣芽孢杆菌中原始CcpA基因由于被SEQ ID NO.3所示的外源基因插入而失活；CcpA基因经外源基因插入后基因序列变为SEQ ID NO.4。

本发明还提供了上述的碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体K31A在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

本发明还提供了上述的基因在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

本发明还提供了上述的重组表达载体在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

本发明还提供了上述的重组微生物细胞在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

本发明的主要思路如下：

(1)根据蛋白的同源建模预CcpA蛋白的关键氨基酸，对氨基酸进行定点突变；

(2)将得到的突变体蛋白在大肠杆菌中进行异源表达与纯化；

(3)在体外对突变体与核酸的结合能力进行筛选；

(4)将筛选得到的突变体蛋白构建CcpA蛋白重组表达质粒；

(5)CcpA突变体K31A蛋白体内影响验证，验证其在菌体内对木糖与葡萄糖利用的影响。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种革兰氏阳性菌，具有耐热、酶系丰富、产酶量高、生长速率适中、蛋白折叠、全基因组信息公开等优点。与大肠杆菌相比，地衣芽孢杆菌具有耐热性高、pH耐受性较低、生物量高等优势，因此，不仅广泛地被用于外源基因的表达宿主，在发酵工业上也具有巨大的潜力。

木糖作为一种优质碳源，可以通过木质纤维素水解而得到，随着目前环境与能源的压力，木质纤维素等可再生的碳越来越受到人们的青睐。地衣芽孢杆菌可以利用木糖，但是其对木糖的利用会受到葡萄糖的抑制。而木质纤维素在水解过程中产生大量木糖的同时，也会产生大量的葡萄糖。由于碳分解代谢阻遏效应，葡萄糖的存在会抑制地衣芽孢杆菌对木糖的利用，为了消除葡萄糖存在而产生的碳分解代谢阻遏效应，许多解除或者降低碳分解代谢阻遏效应的尝试已经在其他的微生物中进行，主要分为两类：一是通过人为构建代谢途径的方式增加木糖的利用；二是通过对细菌本身的代谢途径进行干预，来构建碳分解代谢阻遏降低的工程菌。但是通过敲除碳分解代谢调控蛋白CcpA蛋白的方式来抑制碳分解代谢阻遏，降低葡萄糖对木糖利用的抑制，增加木糖的利用效率，菌体生长会受到明显的抑制作用，其他的代谢途径也受到明显的影响。因此通过基因敲除构建的工程菌未能投入商业化生产。

因而，目前本领域普遍认为单纯敲除碳分解代谢调控蛋白会导致菌体生长受限，破坏菌体的代谢途径，往往得不到人们预期的结果，随着蛋白质工程的进步，对蛋白的理性改造越来越受到人们的青睐。因此通过对碳分解代谢调控蛋白的活性位点的定向改造来降低由于葡萄糖的存在而引起的木糖利用抑制可能是一个有效的手段。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明对从地衣芽孢杆菌中克隆的CcpA基因进行突变，得到的一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体K31A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码其的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了包含编码上述CcpA突变体K31A基因的重组表达载体，并将构建的表达载体转化到地衣芽孢杆菌CcpA基因缺陷菌株中获得重组地衣芽孢杆菌；所获得的重组地衣芽孢杆菌能够明显改变由于葡萄糖存在而产生的碳分解代谢阻遏现象，能够降低地衣芽孢杆菌对木糖的偏好性。

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