本发明公开了一种促进肌肉干细胞增殖的方法,属于细胞培养和生物技术领域。本发明设计了体外有效扩增肌肉干细胞的培养基,包括L 抗坏血酸、D 抗坏血酸和/或胰岛素样生长因子 I。应用本发明优化的培养基培养的肌肉干细胞培养21天后,总细胞数量增加超过106倍,Pax7+细胞比例仍超过60%;经扩增后的肌肉干细胞能够经诱导分化形成大量典型的肌管,表达肌纤维特异性蛋白MyHC和Actin。实现了肌肉干细胞的有效扩增,对肌肉干细胞的大规模培养用于制备干细胞移植物和细胞培养肉生产具有重要意义。

(1)应用含(a)的培养基培养PAX7+肌肉干细胞，培养期间更换2-3次新鲜的含(a)的培养基；可选地，在起始后第3±0.5天，更换1次新鲜的含(a)的培养基；

(2)培养起始后第11～13天，将培养基更换为含(b)的培养基，培养期间更换2-3次新鲜的含(b)的培养基；可选地，在起始后第14～16天，更换1次新鲜的含(b)的培养基。

在一种实施方式中，在培养起始后第19～21天，终止培养，收获肌肉干细胞。

在一种实施方式中，所述肌肉干细胞的来源包括但不限于人、猪、牛、兔或禽类。

本发明的第二个目的是提供组合物A或组合物B在单独或共同用于制备促进肌肉干细胞扩增的产品中的应用；其中：

组合物A：20～500uM L-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I；

组合物B：20～500uM L-抗坏血酸，10～300uM D-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I。

肌肉干细胞又称肌卫星细胞，是位于肌肉组织基膜和肌细胞膜之间的一类单核干细胞。它是肌肉组织生长发育和损伤修复过程中最关键的祖细胞，当肌肉受到损伤时，处于静息状态的卫星细胞会被激活，开始迅速大量增殖，并可以启动分化程序，最终分化、融合形成新的肌管细胞，使骨骼肌得以快速地修复和再生。另外，卫星细胞还可以分化为成骨细胞和脂肪细胞等，能够为新生肌肉提供营养和稳定的支持，增加新生肌肉脂肪的含量，从而提高肌肉损伤修复效。

骨骼肌再生障碍是多种疾病类型如肌肉萎缩、糖尿病、癌症等疾病的常见并发症，也是衰老、肥胖、宇航员等人群的常见生理现象，这类患者和人群的肌肉组织功能、结构形态、生化指标发生一系列变化，肌肉重量减轻、力量减弱，严重影响了个体的活动状态，甚至危及生命健康。利用干细胞治疗骨骼肌再生障碍疾病是临床上一种新兴、有效的治疗策略，具体指通过移植肌肉干细胞到患者体内，补充肌肉干细胞的数量并重建肌纤维，进而达到修复受损肌肉组织的目的。

此外，近年来新提出的细胞培养肉概念，就是利用肌肉干细胞作为种子细胞，遵循肌肉组织的生长发育和损伤修复规律，在体外进行肌肉干细胞的培养，促进其增殖和分化，生产出人造肌肉组织，是一种颠覆传统农业系统的新兴肉类生产方式。

无论是干细胞治疗还是细胞培养肉领域，肌肉干细胞数量不足的问题一直是限制其大规模应用的重要因素。肌肉干细胞在体内的数量极其稀少，需要通过组织分离提取肌肉干细胞，对其在体外进行大量扩增，获得大量具有成肌分化功能的肌肉干细胞，这是实现移植治疗或细胞培养肉制造目的最关键的一步。

该成果发明人：周景文 关欣 方佳华 雷庆子 陈坚 堵国成 余世琴

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明设计了体外有效扩增肌肉干细胞的培养基，不仅可以大量获得可供基础研究的肌肉干细胞，更重要的是可以满足肌肉干细胞临床移植需要和构建用于细胞培养肉制备的种子细胞库。

目前的肌肉干细胞扩增方法实现了其扩增，但在干细胞的分裂过程中，一个子细胞保留干性，但另一个则向下游分化，因此扩增后保持干性的细胞数量大大下降，即无效扩增。本发明使用含有L-抗坏血酸、D-抗坏血酸、IGF-1的扩增肌肉干细胞的配方来有效扩增肌肉干细胞，与传统方法相比，具有以下优势：促进肌肉干细胞的有效增殖，培养21天总细胞数量增加超过106倍，Pax7+细胞比例仍超过60％；经扩增后的肌肉干细胞能够经诱导分化形成大量典型的肌管，表达肌纤维特异性蛋白MyHC和Actin。实现了肌肉干细胞的有效扩增，对肌肉干细胞的大规模培养用于制备干细胞移植物和细胞培养肉生产具有重要意义。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。