本发明公开了一种提高多铜氧化酶稳定性和降解生物胺能力的方法,属于生物工程技术领域。本发明将过氧化氢酶CAT与多铜氧化酶MCOF按顺序连接,利用大肠杆菌表达系统BL21(DE3)/pET28a,成功实现了多铜氧化酶与过氧化氢酶的融合表达,所获得的融合酶可使多铜氧化酶稳定性提高51%~68%。将融合酶用于生物胺的降解,可使多铜氧化酶对不同生物胺的降解能力有不同程度的提高。在24~48h时间内,相较于未融合CAT的多铜氧化酶MCOF,融合酶CAT&MCOF降解生物胺的能力提高了38.9~132%。

本发明的第一个目的是提供一种多铜氧化酶与过氧化氢酶的融合酶，含有SEQ IDNO.5所示氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述融合酶的基因。

在一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.6所示序列。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体为pET28a。

本发明的第四个目的是提供表达所述融合酶的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞为重组大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以***(DE3)为宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供一种提高多铜氧化酶活性和/或稳定性的方法，所述方法是将过氧化氢酶与多铜氧化酶融合。

在一种实施方式中，所述提高多铜氧化酶活性是指提高多铜氧化酶降解生物胺的活性。

在一种实施方式中，所述过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述多铜氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述融合是将所述多铜氧化酶的氨基酸N端与过氧化氢酶的C端连接。

本发明的第六个目的是提供一种降解生物胺的方法，是将所述融合酶加入至含生物胺的环境中，于35～40℃反应至少8h。

在一种实施方式中，所述方法是将所述融合酶加入至生物胺含量为50～100mg/L的反应体系中，于37℃反应8～48h。

在一种实施方式中，所述生物胺包括但不限于组胺、尸胺或腐胺。

本发明还要求保护所述融合酶或表达所述融合酶的重组微生物细胞在食品领域降解生物胺方面的应用。

生物胺是生物体内产生的一类低分子量含氮有机化合物的总称，是发酵食品卫生标准中的一个限制性指标。适量的生物胺可以促进人体正常的生理活动，但通过食物摄入过量生物胺则会引起偏头痛，头痛，胃和肠道问题以及假性过敏反应等不良反应，严重时可能危及生命。因此，需要将其在发酵食品中的含量降至合适的浓度。

目前用于控制和减少发酵食品中生物胺的措施主要可分为三种：1、源头减控。对生产原料进行优化，减少原料中的蛋白质，控制游离氨基酸的数量，这种方法可以减少生物胺的生成。其弊端在于这种方法极大可能会对产品风味和品质造成较大影响。其它方法如减少发酵体系中产胺的微生物一般仅适用于封闭的单菌体系发酵，对于混菌体系或者开放体系(易染菌)效果不大。2、过程减控。这涉及到改进食品加工方法，对发酵条件(如发酵温度、发酵时间、pH等条件)进行优化以及添加外源抑制剂等来减少因菌株代谢及酶促反应而生成的胺前体物质，从而达到抑制胺产生的目的。但即使改变发酵条件，依然会有生物胺生成，且产品的加工温度和盐度等因素多由食物特性决定，而低温贮藏会提高设备和能耗费用。3、末端减控，也称为酶法减控。这种方法可以消除已生成的生物胺，且基本不用调整和改变食品发酵工艺，对食品营养和风味的影响也较小，是目前最具有应用前景的方法。

多铜氧化酶是一种含铜的氧化酶，目前发现多铜氧化酶类中的某些酶可以降解生物胺，但在降解生物胺时因其稳定性不高，对生物胺的降解率低而在实际应用中受到限制。

该成果发明人：方芳 倪秀梅 陈坚 堵国成

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本发明通过对多铜氧化酶和过氧化氢酶的融合表达，得到一种稳定性提高的融合酶，该酶的多铜氧化酶稳定性可提高51％～68％；将该融合酶用于降解生物胺，可使多铜氧化酶对不同生物胺的降解能力有不同程度的提高，相比于未融合的酶可以提高38.9～132％。

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