本发明公开了一种噬热β 葡萄糖苷酶的制备及应用,属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明通过构建重组菌,异源表达了来源于嗜热真菌Talaromyces piceae的β 葡萄糖苷酶TpBgl3A,所述重组菌在3.6L发酵罐中产酶可达2324U/mL。生产得到的β 葡萄糖苷酶TpBgl3A能在较低加酶量下利用葡萄糖为底物高转化率制备低聚龙胆糖,显著降低生产成本;在以葡萄糖和纤维二糖为底物的反应体系中,低聚龙胆糖转化率达到26.2%,具有工业化生产低聚龙胆糖的潜力。

β-葡萄糖苷酶可水解释放β-D-糖苷类化合物非还原端葡萄糖基，是纤维素降解酶系的重要成员，可防止纤维素降解过程中纤维二糖的积累，从而有效解除纤维二糖对上游内切纤维素酶和外切纤维素酶的强烈产物抑制。

本发明提供一种β-葡萄糖苷酶TpBgl3A成熟蛋白的编码基因的序列，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述β-葡萄糖苷酶TpBgl3A成熟蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了一种载体，所述载体携带编码β-葡萄糖苷酶TpBgl3A的基因，或表达β-葡萄糖苷酶TpBgl3A。

在本发明的一种实施方式中，所述载体的出发载体为pPIC9K。

本发明提供了一种重组菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A，所述重组菌是以毕赤酵母KM71为宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-葡萄糖苷酶TpBgl3A。

本发明提供了一种提高β-葡萄糖苷酶产量的方法，所述方法是将所述重组菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A进行高密度发酵得到。

在本发明的一种实施方式中，将重组菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A，以8％～12％接种量接种于发酵罐中，控制温度28～30℃、初始转速180～220rpm、初始通气量5～8L/min、溶氧28～32％、pH 4.5～5.5；待溶氧上升至80～100％，以恒速流加甘油的方式进行补料培养；当重组菌菌体细胞浓度在OD600为100～200时，用甲醇流加仪流加甲醇诱导产酶，控制温度15～25℃。

在本发明的一种实施方式中，所述甘油的浓度为80％(v/v)，甘油流加速率为15～25mL/h。

在本发明的一种实施方式中，初始诱导菌体的OD600为100～200，甲醇浓度为0.5％～2.0％(v/v)，诱导温度为20℃～35℃。

在本发明的一种实施方式中，所述高密度发酵条件为：当重组菌菌体细胞浓度在OD600为130～170时，添加浓度为0.8％～1.5％的甲醇诱导产酶，控制温度22℃～28℃。

本发明提供了一种提高低聚龙胆糖产量的方法，所述方法是以700～900g/L葡萄糖为底物，以所述β-葡萄糖苷酶为催化剂进行反应。

低聚龙胆糖是葡萄糖以β-1,6糖苷键结合而形成的新型功能性低聚糖，包括龙胆二糖，少量的三糖和四糖。低聚龙胆糖不被人体的酶所降解，低热量，适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用；其还具有高保湿性和吸湿性，有利于保持食品中的水分，可防止淀粉类食品的老化；同时低聚龙胆糖pH和热稳定性高，适用于高温和特殊pH条件下使用的食品；其水活性低，可以有效的防止食品被微生物污染；还具有柔和的提神苦味，可以添加在食品中增加口味的丰富性。目前，低聚龙胆糖被广泛的运用于巧克力、冰淇凌、咖啡、调味品、烘烤食品和饮料中。

龙胆低聚糖最早从龙胆属植物根茎中提取、酸法水解淀粉得来，这两种方法产率极低且产物成分复杂不易分离提取，化学合成得率高但又易造成污染，所以酶法生产在目前已成趋势，目前研究主要集中在利用β-葡萄糖苷酶以葡萄糖为底物通过转糖基作用聚合形成产物，β-葡萄糖苷酶分布于糖苷水解酶(Glycoside hydrolysase,GH)1、3、5、9、30和116等6个家族中，广泛存在于植物、动物和微生物中，其中微生物来源更为广泛，目前报道的这些菌株产β-葡萄糖苷酶用于生产低聚龙胆糖主要存在三个问题，一是低聚龙胆糖产率低，二是加酶量偏高，三是高密度发酵中的产酶量不足。

因此，本发明的目的不仅在于提高低聚龙胆糖的转化率和降低生产所需的加酶量，还要构建一种能够在高密度发酵中高效表达重组酶的基因工程菌。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明保护所述载体在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明保护所述提高β-葡萄糖苷酶产量的方法在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明还保护所述提高低聚龙胆糖产量的方法在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明的有益效果：本发明将来源于Talaromyces piceae的β-葡萄糖苷酶异源表达到毕赤酵母中，以pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，得到一株高产β-葡萄糖苷酶的基因工程菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A，将基因工程菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A在3.6L发酵罐中产酶可达2324U/mL。生产得到的β-葡萄糖苷酶TpBgl3A较现有生产中的同类酶，加酶量低且底物转化率和低聚龙胆糖产量高，在加酶量为300U/g条件下，低聚龙胆糖产量最高能达到125.0g/L，转化率为15.62％，具有良好的工业价值。

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